[发明专利]用于检测水不混溶性化合物的微生物生成的方法和组合物

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求2011年5月13日提交且题为“用于检测水不混溶性化合物的微生物生成的方法和组合物”的美国临时专利申请No.61/486,211的优先权，据此其通过提述完整并入。

技术领域

本文中提供的方法和组合物一般涉及微生物的工业用途。具体地，本文中提供了对于检测细胞中工业上有用的化合物的生成有用的方法和组合物，所述细胞例如经遗传修饰以与未经遗传修饰的亲本微生物细胞相比更高的产率和/或提高的持久性生成一或多种这类化合物的微生物细胞。

背景技术

微生物用于生产商业上有用的化合物导致了工业生物技术的出现。可以经由代谢工程来衍生商业生产株，即定向修饰宿主细胞中的代谢通量。代谢工程的一项具体目标是提高有价值化合物的胞内浓度或分泌同时使得其它通量对于存活力和生产力是最佳的。特别期望能够实现高产率（每克底物的化合物克数）、高产量（每升克数）和/或高生产率（每小时每升克数）的重组株。将株工程化改造成期望表型常常作为涉及几轮代谢通量工程化改造、分析和建模的反复过程来进行。然而，代谢工程的所有方法分享共同的限制，即它们依赖于针对改良性状的合适筛选方法。

理想地，针对具有改进性能的株的筛选方法为：(1)足够灵敏以察觉从一种经修饰群体到另一种经修饰群体在性能中的渐增改进；(2)足够特异性以区分内源分子与重组生成的异源产物（不管是包含在细胞内还是分泌到周围培养基中）；(3)足够有力以一次性筛选经修饰株的许多库；和(4)为生产对宿主的代谢影响提供信息。对于后者，可能的情况是宿主中异源基因的输入和表达将导致代谢不平衡和/或毒性代谢物的积累。在这类场景下，知晓生产是否以降低宿主的存活力为代价是有用的。此外，鉴于从一种生成群体到另一种生成群体生物质广泛趋异的可能性，特异性检测重组产物而没有来自细胞生物质的影响或输入的能力能为给定株的产率、产量和/或生产率提供更准确的描述。

先前已经记载了高通量筛选方法，诸如机器人微量滴定板测定法或荧光相关细胞分选。然而，随着代谢工程的新应用的发展，需要更加灵敏、产物特异性、且强力的测定法，特别是关于期望化合物生成和宿主细胞存活之间的相容性提供一些指示的测定法。

发明内容

本文中提供对于检测细胞中重组生成的水不混溶性化合物（WIC）有用的方法和组合物，所述细胞为例如经遗传修饰以与未经遗传修饰的亲本微生物细胞相比更高的产率和/或提高的持久性生成一或多种水不混溶性化合物的微生物细胞。具体地，本文中提供的方法提供用于筛选经工程化改造（例如为了生成工业上有用的水不混溶性化合物，包括但不限于类异戊二烯（isoprenoid）、聚酮化合物、脂肪酸及其衍生物）的微生物菌株的高通量、灵敏且定量的手段。经由使用能够直接结合水不混溶性化合物的荧光染料，及能够对重组细胞群体相对于它的生物质调查生成的化合物的量的选定光谱条件，所述方法容许特异性检测异源胞内或分泌化合物。

在第一个方面，本文中提供在溶液中检测自多个细胞重组生成的水不混溶性化合物（WIC）的方法，所述方法包括：

(a)使溶液与直接结合WIC的荧光染料接触，其中所述溶液包含多个重组生成所述WIC的细胞；并

(b)在适合于选择性检测结合至重组生成的WIC的荧光染料的光谱条件下检测荧光染料。

在一些实施方案中，所述WIC是自重组生成所述WIC的所述细胞分泌的。在一些实施方案中，所述荧光染料是尼罗红。在一些实施方案中，所述荧光染料是BODIPY493/503或BODIPY505/515。

在一些实施方案中，所述包含多个细胞的溶液包含在多孔细胞培养板的孔中。在一些实施方案中，在所述检测之前将所述细胞培养至少12小时的时段。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括测定WIC:细胞生物质比率的步骤。在一些实施方案中，通过包括使用不检测来自结合至WIC的荧光染料的荧光的光谱条件检测所述多个细胞的自身荧光的方法来测定所述细胞生物质。在一些实施方案中，所述荧光染料是尼罗红，而且测定WIC:细胞生物质比率包括测定绿色对红色荧光的比率。

在一些实施方案中，所述适合于特异性检测WIC的光谱条件通过包括下述步骤的方法来确定：