[发明专利]通过离子型表面活性剂选择性裂解细胞

说明书

发明领域

本发明涉及真核细胞的裂解，具体地说涉及动物细胞（如血细胞）的裂解。本发明进一步涉及在含有大量其他细胞的样品中的少量微生物（如细菌或真菌）的检测。

发明背景

分子诊断学旨在快速检测在样品（如血液）中微量的病原体（典型地是细菌）。然而，血液是一种复杂的基质，并且包含用于适应性免疫系统的白细胞（白血球）、用于氧输送的红细胞（红血球）、以及用于伤口愈合的血小板（凝血细胞）。这种组成使得在含有大量细胞物质的样品（如全血）中直接检测病原体变得复杂。

经典的检测方法包括在选择性介质和/或含有指示剂的介质上使细菌生长。在可以进行细菌鉴定之前，这样的分析典型地需要至少1天或2天的培养步骤。

对基于PCR的方法而言，在新鲜血样中的细菌量在理论上高到足以在没有进一步培养存在于这样的样品之内的细菌的情况下被检测到。然而，为了允许及早检测到微量的细菌，需要较大体积的血液。特别是在白细胞中的大量DNA显著增加了基于DNA的检测方法中的背景。来自血红蛋白中的血红素的存在也强烈降低了DNA聚合酶的活性。一微升人全血含有大约4,000到11,000个白细胞和大约150,000到400,000个血小板。DNA在血液中的浓度在30μg/ml与60μg/ml之间。在体积为10ml的全血中检测大约10到100,000个的细菌种类的存在是极其挑战性的。

大量的白细胞DNA可能产生不相关的PCR产物，或者可能清除为检测细菌DNA所设计的引物。这使得在可以通过PCR或其他方法检测细菌DNA之前的真核DNA的彻底DNA纯化和分离成为必需。

除干扰PCR反应本身之外，哺乳动物DNA的量增加了样品的粘度。另外，来自于裂解的哺乳动物细胞的蛋白质和膜形成妨碍样品过滤的复合物。这对小型化装置而言尤其是个问题。进一步稀释较大样品体积导致不可接受的较长操作步骤。

针对以上原因，相应地需要从血样中去除人类DNA的方法。

在哺乳动物DNA存在下明确分析细菌DNA的方法是已知的。来自于SIRS实验室公司（company SIRSLab）的Looxters^TM使用一种方法来富集来自样品的甲基化DNA。由于细菌DNA被强烈甲基化，这种方法导致细菌DNA的富集。来自Molzym公司的Molysis^TM使用离液剂和洗涤剂来选择性裂解哺乳动物细胞。在这个裂解步骤之后用不受这种离液剂/洗涤剂影响的DNA酶消化。替代途径（如由罗氏（Roche）商业化的Septifast^TM）依赖于特别设计为防止与人类DNA的非特异性结合和人类DNA的扩增的PCR引物对。

US 6,803,208描述了一种方法，其中在37℃下使掺杂有细菌的血小板的高度稀释悬浮液裂解15分钟，随后可能在0.4μm过滤器上过滤少量的裂解样品，以用于目视检查保留在过滤器上的细菌。然而这种方法不允许在环境温度下处理较大体积的样品。

皇家菲利浦电子有限公司（Koninklijke Philips Electronics N.V.）的未出版国际专利申请PCT/IB2010/055628披露了一种用于选择性裂解在含有或疑似含有微生物的样品中的真核细胞的方法，其中向包含真核细胞的样品中添加非离子型洗涤剂（如Triton X-100（聚乙二醇p-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基醚）和缓冲剂以获得具有至少9.5的pH值的溶液，并且孵育所述溶液持续充分长到足以裂解真核细胞的时间段。通过裂解在样品中的白细胞和红细胞，在保持病原性微生物完整的同时使血细胞DNA降解，这种方法允许处理具有5ml的体积的血样，并且可以随后通过离心或过滤进行富集。