[发明专利]用于对混合群体中的靶DNA进行测序的试剂盒和方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年2月28日提交的美国临时专利申请No.61/447,490和2011年9月9日提交的美国临时专利申请No.61/532,887的优先权，二者均以其整体援引加入本文。

发明介绍

本发明涉及对含有其它参考序列的核酸样品中的靶DNA序列的DNA测序进行改进。所述参考序列和靶序列可以是紧密相关的，例如所述靶序列可以是所述参考序列的等位基因、所述参考序列的突变的形式、来自不同的株或种的参考序列。具体而言，本发明涉及封闭核酸在DNA测序反应期间用于封闭对参考序列而非靶序列的测序的用途。

DNA测序使得可以通过使用特异于核酸特定区域的测序引物来鉴别具体的DNA序列。该方法非常有力并且快速地提供序列信息，仅仅只要测序引物特异于样品中的一个序列。测序中常常遇到的问题是，当序列的群体是混合的时候，测序引物会针对两种序列，使得这两种序列不能适当解析。一直存在着对在相关联的参考序列背景中对靶序列进行鉴别和测序的新开发的测序方法的需要。

发明概述

本文提供了用于对具有相关的参考序列的样品中的靶DNA序列进行测序的试剂盒和方法。所述试剂盒包括与靶序列一条链的一部分和参考序列一条链的一部分互补的测序引物，以及与参考序列一条链的至少一部分完全互补并且与靶序列的任一条链都不完全互补的封闭核酸(BNA)。所述测序引物和所述封闭核酸互补于所述参考序列的同一链，并且所述封闭核酸在3’端被封闭使得其不能被聚合酶延伸。所述试剂盒还可以包括标记的链终止三磷酸核苷酸.

在另一方面，还提供了用于扩增靶序列并对靶序列进行测序的试剂盒。另外，在上文所述的试剂盒中的要素之外，这些试剂盒还包括不与所述测序引物结合相同靶序列链的5’-磷酸化的扩增引物。所述试剂盒还可以包括λ外切核酸酶以降解包含5’-磷酸酯的扩增产物。

在另一方面，提供了制备样品中的靶序列以进行测序的方法。所述方法包括将具有参考序列并且还疑似具有一或多个靶序列的样品加入到DNA测序反应混合物中以形成反应混合物。所述DNA测序反应混合物包括测序引物和过量的封闭核酸。所述封闭核酸与参考序列一条链的至少一部分完全互补并且与靶序列的任一条链都不完全互补。所述封闭核酸在3’端被封闭从而其不能被聚合酶延伸，并且所述测序引物和所述封闭核酸都互补于所述参考序列的同一链。使疑似具有靶序列的反应混合物经受第一变性温度(高于参考序列和靶序列的解链温度(T_m))以形成变性的参考链和变性的靶链。继而将反应混合物的温度降低以允许形成封闭核酸和互补参考链的双链体以及封闭序列和靶链的异源双链体。继而使反应混合物经受临界温度(T_c)，与使封闭核酸和互补参考链的双链体变性相比，所述临界温度足以优先使封闭核酸和互补靶链的所述异源双链体变性。继而将反应混合物的温度降低以使所述测序引物退火至反应混合物中的游离靶链和游离参考链。最终，延伸测序引物以产生延伸产物，所述延伸产物能够被分析以使所述靶序列的核酸序列被确定。

在另一方面，在上文所述的测序方法之前或者与其同时，可以用PCR扩增靶序列。在一个实施方案中，可以选择性地降解所扩增的靶序列的一条链。适宜的是，所降解的链是互补于测序引物的链。在一个实施方案中，将5’-磷酸化的扩增引物与测序引物一起加入到PCR反应中并扩增靶序列。可以通过与λ外切核酸酶温育来降解所扩增的包含5’-磷酸酯的靶序列的链。

在参阅附图和下文的详述之后，本领域技术人员可以明了本发明的其它实施方案以及优势。

附图简述

图1是本文所述方法的描述。

图2是使用反向M13引物的K-RAS G12V和野生型DNA的一组测序电泳图。样品含有85%的野生型和15%的G12V突变DNA。

图3是使用正向M13引物的K-RAS G12V和野生型DNA的一组测序电泳图。样品含有85%的野生型和15%的G12V突变DNA。

图4是在初始的K-RAS G12R的Ice-COLD-PCR及随后使用反向封闭核酸(BNA)和反向M13引物的BLOCker^TM测序之后，K-RAS G12和野生型DNA的一组测序电泳图。PCR的初始样品含有99%的野生型和1%的G12R突变DNA。顶端一幅显示了在测序反应中含有0nM BNA的反应的结果，第二幅显示了含有50nM BNA的反应的结果，第三幅显示了含有75nMBNA的反应的结果以及第四幅显示了含有100nM BNA的反应的结果。