[发明专利]用于对混合群体中的靶DNA进行测序的试剂盒和方法

权利要求书

1.对具有参考序列的样品中的靶DNA序列进行测序的试剂盒，其包含测序引物和封闭核酸，所述测序引物与靶序列的一条链的一部分和参考序列的一条链的一部分互补，所述封闭核酸与所述参考序列的一条链的至少一部分完全互补，其中所述测序引物和所述封闭核酸与参考序列的同一链互补，并且其中所述封闭核酸在3'端被封闭使得其不能被聚合酶延伸。

2.权利要求1的试剂盒，还包含标记的链终止三磷酸核苷酸。

3.权利要求1或2的试剂盒，其中所述靶序列和所述参考序列能被变性以产生靶链和参考链，并且其中在允许杂交的条件下所述封闭核酸能够与完全互补的参考链形成同源双链体和与部分互补的靶链形成异源双链体。

4.权利要求3的试剂盒，其中所述封闭核酸和互补靶链的异源双链体的变性温度低于所述封闭核酸和互补参考链的双链体的变性温度。

5.权利要求4的试剂盒，其中所述测序引物能够在低于临界温度的温度退火至靶链。

6.权利要求1-5任一项的试剂盒，其中：

所述测序引物的3'端能够在邻近所述参考序列的链上的结合所述封闭核酸5'端的碱基处与所述参考序列的所述链结合；

或者所述测序引物的3'端和所述封闭核酸的5'端与所述参考序列的至少一个相同碱基互补。

7.权利要求1-6任一项的试剂盒，其中所述封闭核酸上的5'端包含阻止DNA聚合酶从5'至3'的外切核酸降解的核苷酸。

8.权利要求1-7任一项的试剂盒，其中所述封闭核酸是单链核酸.

9.权利要求1-8任一项的试剂盒，其中所述封闭核酸包含DNA、RNA、肽核酸、锁核酸、另外的修饰的核苷酸或者其组合。

10.权利要求9的试剂盒，其中所述封闭核酸中肽核酸、锁核酸或另外的修饰的核苷酸的位置经选择以匹配所述参考序列和所述靶序列疑似不同的位置。

11.权利要求10的试剂盒，其中使所述封闭核酸和互补靶链的异源双链体变性所需的温度与使所述封闭核酸和参考链的双链体变性所需的温度之间的差异被最大化。

12.权利要求9-11任一项的试剂盒，其中所述封闭核酸中肽核酸、锁核酸或另外的修饰的核苷酸的位置经选择以提供横跨所述封闭核酸的更恒定的解链温度。

13.权利要求1-12任一项的试剂盒，还包含5'-磷酸化的引物，其中所述5'-磷酸化的引物不与所述测序引物互补于同一链。

14.权利要求13的试剂盒，还包含5'-磷酸酯依赖性外切核酸酶。

15.权利要求1-14任一项的试剂盒，其中所述靶序列或所示参考序列包含K-RAS外显子2密码子12和/或13。

16.权利要求1-14任一项的试剂盒，其中所述靶序列或所述参考序列包含线粒体突变。

17.权利要求16的试剂盒，其中所述线粒体突变与MELAS相关。

18.权利要求1-14任一项的试剂盒，其中所述靶序列或所述参考序列包含HPV核酸。

19.权利要求1-14任一项的试剂盒，其中所述靶序列或所述参考序列包含BRAF外显子11和/或外显子15。