[发明专利]用于裂解细胞的方法

说明书

本发明涉及用于裂解细胞尤其是细菌细胞和分离核酸的方法。将样品用包含与水不能混溶的至少一种液体的裂解溶液处理且加热。然后将混合物冷却并且加入水，使得在冷却后生成两相系统。核酸可以在水相中找到。

发明背景

核酸例如DNA广泛用于分子生物学领域中用于研究和临床分析。用于分析DNA的常见方法是DNA印迹、通过诸如聚合酶链反应（PCR）的方法扩增、和测序。使用这些方法，测定DNA序列中的差异，以帮助基因鉴定、群体筛选、病原体鉴定和诊断测试。所有这些分析都需要纯化的DNA样品作为一致和有效结果的基础。

核酸分离步骤一般在核酸的分析和体外操作前，以便使核酸不含不需要的污染物，所述污染物可以干扰后续处理程序。对于研究和诊断分子生物学的绝大多数程序，需要提取的核酸作为第一个步骤。在一般的DNA提取方案中，收获且裂解含有目的核酸的细胞。

细胞裂解是在用基于核酸的方法例如PCR和克隆技术进一步处理前，通过破坏细胞膜从细胞中释放材料的过程，并且特别是从细胞中提取细胞内材料以分离DNA或RNA的过程。

通过细胞破裂的细胞裂解方法可以分类成机械方法和非机械方法。

机械方法包括超声破碎、使用匀浆器的破坏、使用例如弗氏压碎器等的挤压、减压、粉碎等。非机械方法包括化学方法、热方法、酶促方法等。

其为非机械方法的化学方法使用例如酸、碱、去污剂、溶剂、离液试剂等。尤其地，使用去污剂的化学方法被广泛使用。去污剂破坏脂质双膜以释放细胞内容物且裂解膜蛋白质。去污剂最常用于裂解动物细胞。大多数去污剂使蛋白质变性。然而，用于细胞裂解的试剂是分开添加的，并且因此需要去除试剂的后续过程。可以发生PCR抑制，并且该过程花费长时间。

酶促方法使用溶菌酶、蛋白酶等。

热方法包括冻融、加热、渗透冲击、电冲击等。例如，细胞裂解通过使细胞与热物体例如热板接触或通过重复冷冻至-70℃和解冻至室温的循环来实现。

在US 2006/0141556中，通过将微波辐射到样品上升高样品的温度来执行细胞裂解。蒸气压中的增加通过将两性离子化合物或离子液体加入样品得到预防。

仍存在快速和有效裂解方法的需要。

发明概述

已发现细胞尤其是细菌细胞可以通过下述有效裂解：向样品中加入包含水不混溶的液体的裂解溶液，加热混合物且在冷却后加入水或含水缓冲液以生成两相系统。核酸可在水相中找到，并且可直接转移至进一步的下游操作如PCR。

因此，本发明涉及通过下述用于裂解细胞的方法

a）提供包含细胞的样品

b）向样品中加入至少包含水不混溶的液体的裂解溶液

c）将步骤b）中获得的混合物加热至高于80℃的温度

d）在步骤c）中的温度高于100℃的情况下，将样品冷却至低于100℃的温度

e）将水或含水缓冲溶液加入混合物中，从而生成水不混溶的液相和水相。

在优选实施方案中，细胞是细菌细胞。

在优选实施方案中，将混合物加热至100 – 150℃。

在优选实施方案中，在步骤d）中，将样品冷却至20 – 40℃。

在优选实施方案中，在步骤b）中加入的裂解溶液包含至少一种油或至少一种离子液体。在非常优选的实施方案中，它包含至少一种离子液体。

在优选实施方案中，在步骤b）中加入的裂解溶液包含至少一种基于双（三氟甲基磺酰基）酰亚胺[Ntf₂]的离子液体。这意指离子液体的阴离子是双（三氟甲基磺酰基）酰亚胺[Ntf₂]。

在优选实施方案中，在步骤b）中加入的裂解溶液包含三己基（十四烷基）鏻三（五氟乙基）三氟磷酸酯[Ttp][Fap]和/或1-丁基-1-甲基吡咯烷双（三氟甲基磺酰基）酰亚胺[bmpyrr][Ntf₂]。

在对于革兰氏阳性细胞尤其优选的一个实施方案中，在步骤b1）中加入裂解溶液前，使样品与至少一种基于N,N-二甲基乙醇铵[DMAE]的离子液体预温育。这意指离子液体的阳离子是N,N-二甲基乙醇铵[DMAE]。

在一个实施方案中，在步骤e）后，使所得到的混合物与蛋白酶温育。

在一个实施方案中，在步骤e）和与蛋白酶的任选温育后，通过PCR方法特别是通过实时PCR、电泳（琼脂糖或聚丙烯酰胺）或克隆技术如连接或限制性酶消化，直接分析水相中的核酸。