[发明专利]用于检测HPV核酸的材料和方法

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求2011年2月24日提交的美国临时申请No.61/446,306及还有2011年5月13日提交的美国临时申请No.61/486,118的优先权，其在此都通过提及完整并入。

发明背景

1.领域

本公开内容涉及用于测定样品中核酸存在的方法、组合物和试剂盒，所述核酸包括源自人乳头瘤病毒(HPV)的核酸。

2.相关技术的描述

人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的最重要原因，其中13类引起HPV相关宫颈疾病和癌症。使用分子测试针对致癌性HPV DNA的筛选已经可用于诊断HPV相关疾病。然而，目前的测试方法不能精确预测哪些感染可以形成癌症，因为大多数HPV感染是短暂的，并且自发消退和清除。因此，探索其它生物标志物以在反射测定法(reflex assay)中使用以确认哪些感染会进展并且需要进一步治疗。

疾病进展可以与某些HPV基因的表达相关。因此，HPV mRNA的检测可以是重度感染的别的生物标志物。开发用于诊断学的一些HPV mRNA测定法检测单一类型的转录物种类，诸如E6或E7致癌性序列。这些测定法不能预测重度感染，因为单一种类的丰度可以变动，这是由于在疾病过程期间发生的复杂表达样式，或由于免疫应答对HPV的降解所致。另外，mRNA靶物在收集后可能降解，或者收集标本中的感染细胞数据可能较低，这两者可以影响测定结果。作为一种解决办法，设计用于同时检测一定比率的两种mRNA种类的HPV测定法可以比检测单一mRNA种类的测定法更能预测疾病。

另外，HPV DNA通常以每个细胞50-100个拷贝以环状附加体状态以生产性感染维持。在此状态中，HPV癌基因E6和E7的转录受到E2蛋白紧密控制。E6和E7分别靶向p53和pRb，并且如此干扰正常的细胞周期。消除此转录控制的细胞由于其加速再进入细胞周期中而比其它细胞具有增殖优势。

破坏或删除E2基因(如经常在病毒整合入宿主基因组中期间发生的)消除对E6和E7的负反馈，活化端粒末端转移酶，并脱阻抑hTERT表达，并且如此明显促成细胞永生化的进展及最终癌症进展。

已经利用特定核酸序列和序列变化的检测和表征来检测指示感染的病毒或细菌核酸序列的存在、与疾病和癌症有关的哺乳动物基因的变体或等位基因的存在、和法庭样品中及亲子关系测定中找到的核酸来源的鉴定。牵涉正常生物学过程的RNA种类的表征对于了解各种了解很少的生物学过程可以是重要的。

RNA(例如信使RNA、转运RNA、核糖体RNA、小核RNA、和其它RNA)的检测和表征在许多领域中是一种重要的工具，所述领域包括分子生物学、毒理学和生物化学。信使RNA(mRNA)是一种必需的功能性细胞组分；在基因表达过程期间，mRNA的功能性单链结构被合成，并且充当在蛋白质合成中用于翻译过程的中间模板。mRNA分子的短暂存在以DNA转录成RNA分子开始，并且最终以降解结束。在其寿命期间，mRNA分子在翻译前也可以加工，编辑，并转运。剪接是修饰前mRNA以除去称作内含子的非编码序列的某些区段的过程；保留的区段可以包含蛋白质编码序列，并且称作外显子。有时，可以以几种不同方式剪接前mRNA信息，容许单一转录物编码多种蛋白质。

信使RNA(mRNA)的检测在诊断学中是重要的，因为它可以提供DNA检测不能提供的病毒载量和基因表达信息。这些因素经常给出关于疾病进展和预后的线索。目前用于mRNA检测的技术呈现许多问题，包括复杂性和污染潜力。

最常见的mRNA检测方法包括Northern印迹、核糖核酸酶保护测定法(RPA)和逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。然而，这些中每种技术虽然在灵敏性上提供一些优点，但是需要时间和材料要求。另外，一些技术需要扩增靶mRNA，因为总mRNA仅占总RNA的约1%，并且任何特定的mRNA是小得相当多的百分比。

目前，逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)广泛用于表征RNA转录物。然而，所述方法具有下列限制：1)仅可以共扩增有限数目的特定区；2)突变或可变剪接可以限制特异性引物检测RNA的能力；及3)难以以连续模式方法表征mRNA结构。