[发明专利]用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法

说明书

本申请涉及用于从水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的方法，其包括以下步骤：提供含代谢活性细胞的水性培养基；使水性培养基与疏水性有机溶液接触；从水性培养基中分离疏水性有机溶液，其中与其野生型相比，所述细胞具有催化脂肪酸的β-氧化反应的至少一种酶降低了活性。此外，本发明涉及代谢活性细胞用于从包含所述代谢活性细胞的水性培养基中更好分离出疏水性有机溶液的用途，与其野生型相比，所述细胞的催化脂肪酸的β-氧化反应的酶具有降低的活性，所述酶优选选自FadA、FadB、FadD、FadL和FadE及其变体，更优选FadE变体。

由替代石化燃料的再生原料出发制备精细化工产品的方法的根本问题在于要将一旦得到的通常首先存在于大量的水相之中的产物转移入疏水性有机相中。一方面，为了能够实现中间产物或最终产物的浓缩以及为了能够实现可能地在后续反应步骤中在有机溶液中的合成处理，另一方面，为了通过去除所希望的产物来提高在水相中的反应的产率，或者尤其是当产物的存在由于对生产菌株的毒性或者对相关生物催化剂的抑制而通过该产品不利地影响反应进展时，首先在技术上有意义的范畴内实现该反应，这种转移是必要的。将通常以低浓度存在的产物由大量的水相中直接加热浓缩是不合适的。

传统以石油中所含烃类起始制成的工业上有大量需求的这样的产品的例子是12-氨基月桂酸(ALS)或其甲酯(ALSME)。在生产例如用于生产基于尼龙的管道系统的聚合物时，ALS是一种重要的起始产物。传统上，以石化原料起始，在具有低产率的过程中经由月桂内酰胺制备ALS，月桂内酰胺通过以下步骤来合成：将丁二烯三聚化，随后氢化形成环十二烷，接着氧化成环十二酮，与羟胺进行反应，并随后进行贝克曼重排。在WO2009/077461中描述了一种用于生物技术制备ALS或ALSME的大有前景的新路线。可以使用如在EP11154707中所述的一种液体离子交换剂，在两相体系中进行基于该路线的生物技术方法。

通过萃取将一种产物从水相加工进入到疏水性有机相中的前提条件首先是：该产物具有足够的倾向，在包括不可相互混合的水性亲水相和有机疏水相的两相系统中进入到有机相中，这决定性地取决于各化合物的物理化学特性。具有高比例未被取代的烃的化合物或者仅由未被取代的烃构成的化合物主要富集在疏水相之中，而具有高比例极性基团如含杂原子的官能团的化合物且非常特别是具有电荷的化合物主要或者实际上仅仅存在于水相之中，这使得转移到有机相中变得困难。

通常借助于分配系数，例如根据能斯特方程来描述平衡调节之后化合物在所述两相系统中的分配

α＝C_相1/C_相2。

一种特殊的分配系数是K_ow也称作P-值，该系数表征了辛醇相与水相之间化合物的分配平衡：

K_ow＝P＝C_辛醇/C_水

从疏水相处理产物的另一个前提条件在于，分配已经达到了通过上述方程描述的平衡状态或者至少足够接近于平衡状态。平衡的调节尤其通过两个相之间接触面的大小来确定，在生物技术方法中，这通常是非限制性的因素，因为通过由于维持高的代谢活性细胞密度总归必要的措施诸如水性培养基与疏水性有机溶液的通气和充分搅拌，已增加了接触面。

但在能够有效处理这样一种反应混合物之前，将两相分离是必要的，在所述混合物中所述疏水性有机溶液主要存在于胶束或者其它亚区室之中。将纯水与纯有机疏水性溶剂混合时，如果经常自动形成两个相而无其它协助的情况下，那么由于多种可能的相互作用，将不太容易从复杂的水性培养基中分离出有机疏水性溶液，并且在没有技术支持的情况下，例如通过离心分离会持续数时甚至数天。

对于通过生物技术工艺大规模生产工业需求的化学化合物而言，在开发和应用用于节约资源而快速地生产和处理如ALS的化合物的方法时，在此背景下，相分离的过程是很重要的一个因素。如果在大型反应器中必须从大体积的水相中提取总是溶解于疏水性有机溶液中的产物并且随后对其进行处理，那么除了本来的与生产相关参数诸如底物的类型和数量、培养基的温度和氧含量之外，也要优化疏水性溶液的分离，以便节约资源并且使得整个过程尽可能环保。尤其要提及的是，许多大规模使用的疏水性有机溶剂至少在较长时间接触的情况下对生物技术应用的生物有毒性作用，且在这种背景下为保护生物技术使用的菌株，和为防止细胞溶解时释放的不希望的副产物污染甚至分解目标产物，希望缩短水性培养基中的生物与溶剂之间的接触时间。