[发明专利]山梨木糖假丝酵母及其在制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种新的菌株——山梨木糖假丝酵母ZJB-12164（Candida sorboxylosa ZJB-12164），及其在生物催化4-氯乙酰乙酸乙酯合成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。

（二）背景技术

(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate, (S)-CHBE) 是一种无色透明油状液体，分子式为C₆H₁₁ClO₃，分子量166.6，相对密度1.19g/mL，沸点93-95℃/5mmHg，(S)-CHBE结构如式（Ⅰ）所示。(S)-CHBE作为重要的手性药物中间体，可用于合成他汀类药物—羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶抑制剂，其制剂立普妥（阿托伐他汀钙）是美国第一个年销量超过一百亿美元的药物，目前也是全球最高销量的药物。另外，(S)-CHBE还可以转化生成1，4-二氢吡啶类β-阻滞剂。因此，制备光学活性(S)-CHBE备受研究者的关注。

 (S)-CHBE的制备方法可以分为外消旋体拆分法和不对称催化合成法。由于外消旋体拆分的方法制备效率不高，理论收率仅为50％，且产物的分离纯化困难，因此，对于外消旋体的手性拆分制备(S)- CHBE意义不大。与拆分法相比较而言，采用不对称合成(S)-CHBE受到了更多的关注。以潜手性底物4-氯乙酰乙酸乙酯（Ethyl 4-chloroacetoacetate, COBE）为原料，在一定条件下使其反应生成(S)-CHBE过量，甚至全部为单一的对映体，从而避免和减少拆分过程。由于底物COBE价格便宜，很容易合成，因此不对称合成法是最经济有效的合成(S)-CHBE方法。

以COBE为原料不对称合成制备(S)-CHBE，可分为化学催化法和生物催化法两类。化学催化法是采用手性的钌化合物（例如RuX₂[(S)-BINAP]）作为催化剂不对称加氢还原，产物的e.e.值可达97%以上，但这种方法需要高压加氢，对反应器要求较高，而且所用催化剂价格昂贵，因此生产成本较高；而采用的生物催化剂既可以是提纯的酶，也可以是微生物细胞。由于生物还原需要价格昂贵的辅酶参与，因此，通常采用具备辅酶再生系统的微生物全细胞作为催化剂。微生物法羰基不对称还原制备(S)-CHBE具有反应条件温和，产物单一，立体选择性高等优点，代表着绿色化学的发展方向。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种新菌株—山梨木糖假丝酵母ZJB-12164（Candida sorboxylosa ZJB-12164），及其在羰基不对称还原制备(S)-CHBE中的应用，该菌株稳定性好，立体选择性严格，产物光学纯度高。

本发明采用的技术方案是：

本发明涉及一种山梨木糖假丝酵母ZJB-12164（Candida sorboxylosa ZJB-12164），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No：M 2012420，保藏日期2012年10月22日。

本发明所述的山梨木糖假丝酵母ZJB-12164是通过以下程序筛选得到的：

(1) 将来自于浙江、四川、云南和江苏等地200余份土壤样品加入到生理盐水中，制成土壤悬液并接种于富集培养基中，在30℃，150r/min的摇床上培养直至培养液变浑浊后，按2%（v/v）接种量转接到新的富集培养基中继续培养，培养条件同上。富集培养基配方为：葡萄糖50g/L，黄豆芽100g/L，COBE 12g/L，溶剂为水，自然pH。

(2) 第二次富集培养液经稀释后涂布到平板培养基上，30℃培养箱恒温培养48小时，挑取单菌落转接至斜面培养后保藏，斜面培养条件为30℃培养箱恒温培养48小时。平板培养基及斜面培养基配方为：葡萄糖50g/L，黄豆芽100g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，自然pH。