[发明专利]一种植物乳杆菌定量检测方法及其检测试剂盒和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别是涉及一种植物乳杆菌定量检测方法，所述植物乳杆菌定量检测方法是定量荧光PCR方法，一种植物乳杆菌定量检测试剂盒及其应用。

背景技术

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）是乳酸杆菌中的一种，与人类的生活关系密切，常存在于发酵的蔬菜和果汁中。植物乳杆菌作为人体胃肠道的益生菌群，具有维持肠道内菌群平衡、提高机体免疫力和促进营养物质吸收等多种功能，因而被广泛的作为益生菌添加到功能性食品与保健品中。大量研究表明，只有产品中益生菌的活菌数达到1×10⁶个/ML才能够发挥其应有的功效，因而益生菌活菌数量是评价益生菌制品质量的重要指标。然而目前对多菌复合产品中的植物乳杆菌的定性、定量检测方面缺乏科学、合理、快速的方法。传统生理生化方法易受选择培养基、培养条件、菌种特性等因素影响，检测效率有限，且耗时时间长，一般要2-3天；以16S rDNA序列同源性分析作为细菌系统发育和亲缘关系研究已被普遍应用于乳酸菌的分类鉴定中，但由于植物乳杆菌与戊糖乳杆菌、副植物乳杆菌等具有99%的相似性，利用该方法只能鉴定到属而无法准确到种。

伴随着高通量测序技术的快速发展，大量乳酸菌菌株的基因组图谱已被解析。这些基因组数据可以使我们了解不同益生菌的遗传结构和特点，找出不同菌株的专有特征，从而为不同种乳酸菌的区分和鉴定奠定了基础。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的菌数检测方法易受培养基、培养条件、菌种特性等因素影响，并且检测耗时时间长，检测效率较低的缺陷，提供一种植物乳杆菌定量检测方法及其检测试剂盒和应用。本发明所述植物乳杆菌定量检测方法及其检测试剂盒灵敏度高，特异性强，稳定性好，操作简单、迅捷，能极大提高乳制品中乳杆菌数量的检出效率。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一为：一种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）定量检测方法，其中所述方法包括以下步骤：

（1）提取待检样品的总RNA；

（2）将步骤（1）提取的总RNA反转录成cDNA；

（3）采用特异性扩增植物乳杆菌的引物对，以步骤（2）所得cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增检测，其中所述特异性扩增植物乳杆菌的引物对为：上游检测引物，其序列如序列表中SEQ ID No:1所示；下游检测引物，其序列如序列表中SEQ ID No:2所示；

（4）通过比较待检样品的Ct值和定量外标准品的标准曲线测定样品中植物乳杆菌的数量。

本发明所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）也可简写为植物乳杆菌（L.plantarum），其余乳杆菌命名规则与之相同。

其中步骤（1）所述提取待测样品总RNA的方法为本领域常规的总RNA提取方法。所述总RNA的提取较佳地为通过本领域各种商用的RNA提取试剂盒进行。

其中步骤（2）所述RNA反转录成cDNA的方法为本领域常规的反转录方法。所述反转录较佳地为利用各种商用反转录试剂盒进行。

其中步骤（3）所述特异性扩增植物乳杆菌的引物对包括上游测序引物和下游测序引物，其中：

上游测序引物：5’-GGAGCCGCTATTAGTATTTTCAT-3’，其序列如序列表中SEQ ID No:1所示；

下游检测引物：5’-AATACAAGCAAGTCTTGGACCAG-3’，其序列如序列表中SEQ ID No:2所示。所述引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为通过人工合成途径即得，可以委托服务商进行全序列合成即得。

其中步骤（3）所述荧光定量PCR扩增为本领域常规的荧光定量PCR扩增技术。所述荧光定量PCR程序较佳地为：（1）94℃～95℃，25～30秒；（2）94℃～95℃，5～15秒，（3）60℃，20～30秒，其中步骤（2）～（3）重复30～45个循环，更佳地为：（1）95℃30S；（2）95℃5S，（3）60℃25S，步骤（2）～（3）重复40个循环；4℃保存。