[发明专利]荧光假单胞菌及其在制备反式-4-氨甲基-环己烷甲酸中的应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种利用生物转化方法制备反式-4-氨甲基-环己烷甲酸的方法，特别涉及一种荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）ZJB09-108及其在制备反式-4-氨甲基-环己烷甲酸中的应用。 

（二）背景技术

反式-4-氨甲基-环己烷甲酸结构式如式（Ⅰ）所示（简称为氨甲环酸、止血环酸），是一种作用于纤维蛋白溶解酶系统的止血药，临床上主要用于急性或慢性、局限性或全身纤维蛋白溶解亢进所致的各种出血。也因可竞争性地抑制酪氨酸与酪氨酸酶结合，减少黑色素的生成，用于黄褐斑的治疗。同时也广泛用于化妆品中，能阻断消弭紫外线照射导致的黑色素恶化的进程。还可以加入牙膏，防止牙龈出血。 

反式-4-氨甲基-环己烷甲酸的生产均采用化学法，主要包括以下两种方法： 

1.环己烯法合成反式-4-氨甲基-环己烷甲酸的工艺路线（式（1）） 

式（1） 

2.对氨甲基苯甲酸法合成反式-4-氨甲基-环己烷甲酸的工艺路线（式（2）） 

式（2） 

这两种工艺路线中均须先合成顺反式-4-氨甲基-环己烷甲酸（顺式：反式=65:35），再在强碱性条件下经高温高压转化成反式-4-氨甲基-环己烷甲酸，转化条件苛刻，转化不彻底，后处理复杂，成本高，污染大。 

20世纪80年代以来，随着现代生物技术的发展，以生物体或酶为基础的生物催化技术因高度的化学、区域选择性和立体选择性备受关注。但目前还没有利用生物催化技术制备反式-4-氨甲基-环己烷甲酸的报道。生物催化法不对称转化顺反式-4-氨甲基-环己烷甲酸制备反式-4-氨甲基-环己烷甲酸具有反应条件温和、转化彻底、易操作等优点。 

（三）发明内容

本发明目的是提供一种不对称转化顺反式-4-氨甲基-环己烷甲酸的新菌株—荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）ZJB09-108，及其在制备反式-4-氨甲基-环己烷甲酸中的应用。 

本发明采用的技术方案是： 

荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）ZJB09-108，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No：M2012539，保藏日期2012年12月20日。 

本发明所述的荧光假单胞菌ZJB09-108是通过以下方法筛选得到的： 

(1) 称取采集于浙江等地的150余份土壤样品1g，加入到生理盐水中，制成土壤悬液并接种于分离培养基中，在30℃，150r/min的摇床上培养24小时后，取1 mL转接到新的分离培养基中继续培养24小时。分 离培养基配方为：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5 g/L，顺反式-4-氨甲基-环己烷甲酸10 g/L，溶剂为水，pH 7.2。 

(2) 第二次分离培养液经10倍系列稀释后涂布到平板培养基上，30℃培养箱恒温培养24小时，挑取单菌落转接至斜面培养后保藏，斜面培养条件为30℃培养箱恒温培养24小时。平板培养基及斜面培养基配方均为：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5 g/L，琼脂18 g/L，溶剂为水，pH 7.2。 

(3) 从斜面转接至摇瓶菌体培养基中，30℃培养24小时，收集菌体，用0.85%生理盐水洗涤2次，离心收集菌体，所得菌体与底物顺反式-4-氨甲基-环己烷甲酸1 g分散于1000 mL蒸馏水或缓冲液（磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液等）中，在30℃，150r/min水浴下反应0.5-12小时后，转化液经离心分离去除菌体细胞，上清液用0.45μm微滤膜过滤，滤液通过高效液相色谱检测分析，能降解顺式-4-氨甲基-环己烷甲酸的菌株为目的菌株，最终从中选择出一株顺式-4-氨甲基-环己烷甲酸降解活性最高的菌株（编号为ZJB09-108）。所述菌体培养基配方为：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5 g/L，琼脂18 g/L，溶剂为水，pH 7.2。 

菌株ZJB09-108生理生化特征：