[发明专利]一种尿液中肌酐的液相色谱串联质谱测定方法

说明书

  

技术领域：

本发明属于尿液样本的理化检验技术领域，具体涉及一种尿液中肌酐的液相色谱串联质谱测定方法。

背景技术：

连续完全采集志愿者实验期间的24小时尿液能够提供更准确毒物接触剂量水平。尿液样本的完整性是实验组织者首先需要关心的问题，一般采用肌酐的24小时清除率来确定样本的完整性，或者用肌酐比率来校正尿液浓度。近年来，肌酐作为校正因子广泛应用于烟气相关生物标志物的浓度校正，包括可替宁、NNAL和巯基尿酸等。

尿液中肌酐的检测方法主要有Jaffe法、酶解分光光度法、HPLC法、毛细管电泳法、毛细管区带电泳法、GC-MS法和LC-MS/MS法。LC–MS/MS由于其高灵敏度与选择性，被广泛应用于尿液和血液等生物基质中肌酐的检测。Hoskova发展了一种快速分析肌酐的电喷雾-串联质谱法，尿液样本通过固相萃取后直接进入串联质谱检测。此方法虽然省去了尿液样本的分离时间，但是尿液基质只通过固相萃取后就直接进入质谱分析可能会污染仪器，串联质谱的选择分离远不如液相色谱柱。Park报道了一种LC-MS-MS直接分析尿肌酐的方法，尿液只需甲醇稀释与过滤后就可以进样检测。但是，肌酐在反相C18柱上的保留时间是0.59 min，难以与尿液中水溶性的干扰物分开。本发明旨在建立一种简单、快速、选择性好的LC-MS-MS方法测定尿液中的肌酐。 

发明内容：

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种采用LC-MS/MS测定卷烟尿液中肌酐含量的方法，该方法能快速、准确检测尿液中肌酐的含量，测定结果准确、测定干扰少。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 

一种尿液中肌酐的液相色谱串联质谱测定方法，包括以下工艺步骤：

a、收集志愿者尿液；

b、样品前处理：室温下解冻尿液样品，混合均匀后，取1 mL的尿液并加入10 μL的甲酸酸化到pH=2.5左右，在10000 转/min的条件下离心10 min，离心的混合物过0.22 μm聚醚砜水相滤膜，取5 μL滤液于10 mL棕色容量瓶，加入100 μL浓度为1 μg/mL的肌酐-d3，用纯水定容至刻度；

c、标准工作液的配制：用纯水配制不同浓度的肌酐标准工作溶液

d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度的肌酐标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，肌酐的线性回归方程为y=0.0106x+0.00615，其中Y代表分析物与内标峰面积的比值，X表示尿液中目标分析物的浓度。相关系数大于0.999，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

步骤b中的稀释过程依次加入的肌酐-d3和离心过滤后的尿液的体积分别为100 μL和5 μL。 

在步骤d中，所述的色谱分析条件为色谱柱采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm），初始流动相体系选取50% 溶剂A（0.1% 乙酸水溶液）和50% 溶剂B（0.1% 乙酸甲醇溶液），分析时间为12 min，进样量为5 μL。 

采用色谱柱分析时，选取的洗脱条件：50%的0.1% 乙酸水溶液和50%的0.1% 乙酸甲醇溶液等度洗脱，流动相流速为200 μL/min。 

串联质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式；电喷雾电压为5000V, 雾化气为40 psi, 气帘气的量为30 psi, 辅助加热气的流速为40 psi, 离子源温度为480 oC，射入电压：10 V, 碰撞能：29 eV； 去簇电压：73 V，驻留时间：100 ms。 

本发明具体的工艺过程进一步详述如下： 

1 尿液收集

收集志愿者尿液。

2 样品前处理 

b、样品前处理：室温下解冻尿液样品，混合均匀后，取1 mL的尿液并加入10 μL的甲酸酸化到pH=2.5左右，在10000 转/min的条件下离心10 min。离心的混合物过0.22 μm聚醚砜水相滤膜。取5 μL滤液于10 mL棕色容量瓶，加入100 μL肌酐-d3（1 μg/mL），用纯水定容至刻度，取5 μL滤液引入LC-MS/MS分离分析。

3 LC-MS/MS测定 

（1）LC-MS/MS条件