[发明专利]一种重组肠激酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组肠激酶的制备方法。

背景技术

肠激酶(Enterokinase，EK)是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21.9)。天然肠激酶分子量为150kDa，由1条115kDa重链和1条35kD轻链组成，重链负责在消化道细胞膜上的锚定以及与肠激酶融合蛋白的结合，轻链具有催化活性，可以特异性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并在其羧基端切割，将肠激酶融合蛋白活化为肠激酶，从而启动消化道内各种酶原活化的级联反应。

由于肠激酶识别位点的特异性和切割后在目标蛋白N末端不留任何氨基酸残基，而且可以在pH 4.5～9.5、温度4～45℃范围内特异性水解蛋白底物，因此它已经成为基因工程制药领域融合蛋白切割的的首选工具酶，广泛应用于各种重组蛋白、多肽药物的加工成熟。天然的肠激酶来源有限，需从动物组织分离提取，因为从动物组织提取的肠激酶易残留其他的蛋白酶，对融合蛋白的产生降解；另外，来源于动物组织的肠激酶可能带有未知病毒等动物源性污染，为药物蛋白生产增加了额外的风险。通过基因工程的方法生产的肠激酶轻链，具有天然肠激酶的全酶活性和特异性，在融合蛋白切割中被广泛应用。已有报道的重组肠激酶轻链多为实验室级别，存在大量宿主蛋白残留、镍离子残留和其他杂质，而且作为原辅料进行药物蛋白生产时，其残留不能被有效检测和控制，对药用蛋白的生产中增加许多风险。

发明内容

本发明提供一种重组肠激酶的制备方法，以克服现有技术中重组肠激酶轻链多为实验室规模制备，存在大量宿主蛋白残留、镍离子残留和其他杂质的技术缺陷。

本发明的思路是这样的：通过合成N端带有肠激酶酶切位点的基因，连接到pET-32a(+)质粒中硫氧还蛋白后，在大肠杆菌宿主细胞内融合表达，表达的融合蛋白经外加少量肠激酶后，启动自切割，从而生产具有正确结构的重组肠激酶轻链，分子量约为35KD，含有活性重组肠激酶(35KD)的溶液经阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水层析和冷冻干燥后，可得高纯度、适合药用蛋白生产的重组肠激酶产品。

发明人经过大量创造性劳动或得了本发明。

本发明所要解决的技术问题之一是：提供一种包含肠激酶基因的表达载体。

本发明所要解决的技术问题之二是：提供一种包含肠激酶基因的工程菌。

本发明所要解决的技术问题之三是：提供一种重组肠激酶的制备方法。

因此，本发明的技术方案如下：

1.一种包含肠激酶基因的表达载体，其特征在于肠激酶基因序列为Seq ID No.1。

2.根据1的表达载体，其特征在于，肠激酶基因Seq ID No.1插入质粒pET-32a(+)的BglII和XhoI酶切位点之间。

3.一种包含肠激酶基因的工程菌，其包含1或2所述的表达载体。

4.一种包含肠激酶基因的工程菌，其特征在于，由将2所述的表达载体转化大肠杆菌BL21DE3而获得。

5.一种重组肠激酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)培养3所述的包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达；

(2)收集菌体；

(3)破碎菌体；

(4)收集包涵体，洗涤包涵体；

(5)包涵体复性；

(6)肠激酶原活化；和，

(7)活性肠激酶的纯化。

6.一种重组肠激酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)培养4所述的包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达；

(2)收集菌体；

(3)破碎菌体；

(4)收集包涵体，洗涤包涵体；

(5)包涵体复性；

(6)肠激酶原活化；和，

(7)活性肠激酶的纯化。