[发明专利]一种重组肠激酶的制备方法

权利要求书

1.一种包含肠激酶基因的表达载体，其特征在于肠激酶基因序列为Seq ID No.1。

2.根据权利要求1的表达载体，其特征在于，肠激酶基因Seq ID No.1插入质粒pET-32a(+)的BglII和XhoI酶切位点之间。

3.一种包含肠激酶基因的工程菌，其包含权利要求1或2所述的表达载体。

4.一种包含肠激酶基因的工程菌，其特征在于，由将权利要求2所述的表达载体转化大肠杆菌BL21DE3而获得。

5.一种重组肠激酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)培养权利要求3所述的包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达；

(2)收集菌体；

(3)破碎菌体；

(4)收集包涵体，洗涤包涵体；

(5)包涵体复性；

(6)肠激酶原活化；和，

(7)活性肠激酶的纯化。

6.一种重组肠激酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)培养权利要求4所述的包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达；

(2)收集菌体；

(3)破碎菌体；

(4)收集包涵体，洗涤包涵体；

(5)包涵体复性；

(6)肠激酶原活化；和，

(7)活性肠激酶的纯化。

7.根据权利要求5或6任一所述的重组肠激酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为：接种重组工程菌阳性克隆到LB培养基中，于25-37℃下摇床振荡培养过夜，按1-10％接种量接过夜菌于LB培养基中，37℃下摇床振荡培养到对数期，按1-10％接种量接种到装有发酵培养基的发酵罐中，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧在35％以上，发酵培养基配方如下：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中pH调控，当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，调节补料速度、转速、通气控制溶氧在30％以上，补料4h后，降温至23℃，调节pH至7.0，加入终浓度为0.1-0.5mmol/L的IPTG进行有氧诱导，继续培养6h放罐。

8.根据权利要求5或6任一所述的重组肠激酶的制备方法，其特征在于：步骤(1)培养包含肠激酶基因的工程菌并诱导肠激酶基因表达，具体为：接种重组工程菌阳性克隆200μl到20ml的LB培养基中，于30℃下摇床振荡培养过夜，按4％接种量接过夜菌于500ml的LB培养基中，37℃下摇床振荡培养到对数期，接种到装有6L发酵培养基的发酵罐中，初始参数为：发酵温度37℃，搅拌速度200rpm，通气量15L/min，pH为6.7，调节搅拌转速与通气量以维持溶氧始终在35％以上，发酵培养基如下：酵母浸出粉30g/L，葡萄糖6g/L，十二水合磷酸氢二钠8g/L，磷酸二氢钾4g/L，硫酸铵6g/L，七水硫酸镁1.13g/L，二水氯化钙0.073g/L，补料培养基：酵母浸出粉20g/L，葡萄糖30g/L，50％氨水和30％磷酸用于发酵过程中pH调控；当培养基中养分耗尽，溶氧迅速上升时开始补料，通过控制泵的转速合理控制补料速度，控制溶氧在30％以上，补料4h后，降温至23℃，调节pH至7.0，加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG进行有氧诱导，控制溶氧不低于20％，6h后出罐。

9.根据权利要求5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)破碎菌体的缓冲液为25mmol/L Tris-HCl+5mmol/L EDTA，PH7.5。

10.根据权利要求5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)中洗涤包涵体的缓冲液为2mol/L尿素+1.5％ Triton。

11.根据权利要求5或6任一所述的肠激酶的制备方法，其特征在于，步骤(5)包涵体复性的缓冲液为0.2mol/L尿素+10mmol/LEDTA+25mmol/L Tis-HCL，GSH∶GSSG＝1mmol/L∶0.3mmol/L，PH10。