[发明专利]一种器官型人工皮肤、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于人工器官组织工程技术领域，具体地涉及一种新型器官型人工皮肤及其构建方法。

背景技术

近年来，构建具有表皮和真皮双层结构的器官型人工皮肤一直是研究的重点。体外构建的人工皮肤要求结构与功能与正常皮肤相似，否则只是一层细胞，无法满足实际的研究和应用需要。如美国Advanced TissueSciences公司开发的SKIN2 ^TM皮肤，是将成纤维细胞种植于尼龙网中形成真皮组织，再将角质形成细胞种植于真皮上形成表皮部分。但是现有的人工皮肤模型大多数只有角质形成和成纤维两种细胞，引入皮肤其它细胞的模型研究还不多见，由于细胞种类有限，难以发挥多种细胞间的协同作用，并不能完全用于复制皮肤的正常功能；另一方面，由于角质形成细胞是瞬间放大细胞，自我更新能力有限，易退出细胞周期进入终末分化。这是阻碍器官型人工皮肤进入实际应用的主要瓶颈问题之一。

人工皮肤走过了单层细胞培养、人工表皮立体培养和器官型人工皮肤构建的发展过程。早期开发的所谓人工皮肤仅是单层培养的细胞膜片，后来，滤孔嵌套技术得到应用，人们将表皮细胞移植于胶原凝胶、纤维素海绵等支架上三维培养，构建复层表皮，如商品化的Episkin、EpiDerm和SkinEthic产品。2003年欧莱雅公司的科学家将KC、MC、LC细胞共培养构建新型表皮，使表皮的组成更接近正常皮肤。但它们都属于表皮的组织型培养，还不是真正意义上的器官型人工皮肤。

因此，本领域中存在着对其组成接近于哺乳动物正常皮肤结构的器官型人工皮肤的需求，其在需要皮肤替代物、临时覆盖物和仿皮肤模型等的临床应用、毒理学分析、药理学研究和分析中具有重大的应用意义并提供重要的治疗手段和研究工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够解决现有技术中的上述问题的新型器官型人工皮肤。本发明通过将成纤维细胞种植在脱细胞的羊膜上构建好真皮层，上面覆盖一层基质材料，再将角质形成细胞接种于基质材料上；其次，本发明还将羊水干细胞与重组人胶原蛋白复合成膜后再分别种植成纤维细胞和角质形成细胞，通过气液交界培养形成角质化上皮结构，得到兼具真皮层和表皮层结构的器官型人工皮肤。

因此，在第一个方面，本发明提供了一种器官型人工皮肤(下面有时简称“本发明的人工皮肤”)，其由包括以下成分的生物材料构建而成：成纤维细胞、脱细胞羊膜、基质材料及角质形成细胞。

本发明的器官型人工皮肤还可以由包括以下成分的生物材料构建而成：成纤维细胞、羊水干细胞、基质材料及角质形成细胞。

在本发明的器官型人工皮肤中，主要由成纤维细胞和脱细胞羊膜构成类似于哺乳动物皮肤真皮层的仿真皮层结构，所述角质形成细胞形成类似于哺乳动物皮肤表皮层的仿表皮层结构，所述基质材料形成类似于哺乳动物皮肤基底层的仿基底层结构，由此获得与哺乳动物正常皮肤解剖结构非常相似的人工皮肤。

在本发明的器官型人工皮肤的一个优选实施方案中，成纤维细胞为分离自下述细胞的体外培养物：哺乳动物皮肤的成纤维细胞，优选人源成纤维细胞，包括分离的原代幼儿皮肤成纤维细胞、成人皮肤成纤维细胞和幼儿包皮成纤维细胞，最优选幼儿包皮成纤维细胞的体外培养物。

在本发明的器官型人工皮肤的另一个优选实施方案中，基质材料为亲水性高分子材料，所述亲水性高分子材料优选地由天然的或合成的细胞外基质蛋白形成。细胞外基质蛋白优选地选自纤维连接蛋白、层粘连蛋白、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、玻璃粘连蛋白或其组合，更优选是合成的细胞外基质蛋白，最优选人重组III型胶原蛋白或人重组IV型胶原蛋白。

在本发明的器官型人工皮肤的另一个优选实施方案中，羊水干细胞分离自哺乳动物孕期羊水，优选哺乳动物孕中期的羊水，经体外培养而得。在本发明中，羊水干细胞在体外培养的代数不受限制，只要其表达干细胞特定基因(例如，ssea-4、oct-4，如通过免疫组化测定)即可。优选使用体外培养3～10代的羊水干细胞，这样可以保留羊水干细胞较大的定向诱导和分化能力。

在第二个方面，本发明提供了一种器官型人工皮肤的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)将体外培养的成纤维细胞按照1×10⁵～5×10⁵个细胞/cm³的密度种植在分离自哺乳动物胎盘的脱细胞羊膜上加入培养基培养2～4天构建成仿真皮层；

2)在所述仿真皮层上面覆盖一层厚度约1mm的基质材料；