[发明专利]检测红脂大小蠹的方法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测红脂大小蠹的靶基因以及检测该基因的引物，本发明还涉及利用该引物进行红脂大小蠹检测的巢氏PCR方法及试剂盒。

背景技术

红脂大小蠹是原产于北美针叶林的钻蛀性害虫，尽管其在当地分布广泛，但对植物未造成严重危害，因此被认为是次生害虫。然而，近年来它已成为入侵我国的重大外来入侵林业害虫，该虫为蛀干、蛀根毁灭性害虫，入侵后危害特别严重。上世纪随木材贸易进入我国以后，1998年在山西首次发现，随后迅速爆发蔓延，目前已扩展到河南、河北、陕西等省。2000年山西省发生面积达25万hm2，其中成灾12．9万hm2，涉及山西省8个地市的54个县(区)，造成351．6万株20年以上油松枯死；1999年秋，河北、河南两省也相继发现大面积灾情。至2000年初，3省共发生灾情52万hm2，油松死亡600多万株；2001年在陕西延安等地又发现该虫危害，呈现严重蔓延之势。在国家林业局发布的19种危险性外来有害生物名录上，红脂大小蠹高居榜首，是近年来入侵我国的重大外来有害生物之一，严重危害被入侵地区的生态环境和野生动植物的安全，造成了巨大的经济损失。国家林业局已将红脂大小蠹的治理工作作为应急项目纳入国家级林业有害生物工程治理项目。

尽管红脂大小蠹对我国松树和其他树种造成巨大危害，但是依然无有效和环保的方法来防止和根除红脂大小蠹。植物检疫为防止健康树种感染提供了最有效的方法。为了成功将红脂大小蠹和其他小蠹区别开，已有许多形态学研究，这些研究大多费时、费力且需要专业的形态学知识。而且，处于不同生活史和来自不同国家的小蠹可能会表现出不同的形态特征。近些年，越来越多的研究已证明分子生物学手段能够为鉴定害虫提供有力依据。

基于PCR的技术已广泛用于病原微生物、植物线虫和某些害虫的鉴定中，然而传统一步PCR法因待鉴定物的低数量或基因组DNA低浓度可能导致误鉴定从而引起病原感染或害虫入侵。与传统PCR相比，巢式PCR包括两对引物，具备以下优势：1.模板和引物在两轮PCR中的改变大大降低了非特异性扩增的概率；2.一步PCR中的平台效应克服了，因此大大提高了扩增效率和第二步PCR中的灵敏度；3.内部PCR中的模板是外部PCR的产物，表明二轮PCR的成功扩增是对一轮PCR对应基因序列完整与否的验证。

核酸分子标记基因种类很多，有线粒体DNA，核糖体DNA，微卫星DNA和核蛋白编码基因等，它们均被广泛应用于昆虫的分类鉴定和系统发育研究中。线粒体DNA严格母性遗传，属于细胞器基因组，缺乏细胞核基因组中的保护机制，因而变异较为明显，能够反应较短时间内的进化事件，因而被广泛应用于进出境检验检疫害虫的鉴别。线粒体DNA上的细胞色素氧化酶I基因（COI）因为高度保守，结构稳定，无内含子经常被用于物种分类、鉴定和亲缘关系的研究。本发明以线粒体的COI基因为靶基因设计红脂大小蠹的特异性引物，以达到对其快速检测的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供用于检测红脂大小蠹的引物组合。

本发明的另一目的在于提供检测红脂大小蠹的方法和试剂盒。

基于以上目的，本发明对红脂大小蠹的COI基因与NCBI上公布的其他昆虫的核苷酸序列进行反复比对和筛选，发现红脂大小蠹种内COI基因同源性达99%，而与其他昆虫序列差异大，因此该区段可以很好的区分红脂大小蠹与其他种属昆虫。

本发明提供了一种用于检测红脂大小蠹（Dendroctonus valens LeConte）引物组合，其能够特异地扩增COI基因或其特异性片段。

本发明提供的引物组合第1对引物为通用引物，其核苷酸序列为：LOC1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3’,（SEQ ID NO.1）

HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’（SEQ ID NO.2）如所示；

第2对引物为检测红脂大小蠹的特异性引物，其核苷酸序列为：

F：5’-GAAGGGTCAAAGAAAGTA-3’，（SEQ ID NO.3）

R：5’-GTCAGGGATAGTAGGAAC-3’（SEQ ID NO.4）所示。

本发明提供了含有上述引物组合的试剂盒。

本发明提供了含有上述引物组合的检测试剂。

本发明还提供了一种检测红脂大小蠹的方法，包括如下步骤：

（1）提取昆虫基因组DNA；