[发明专利]一种表达人抗体全基因的慢病毒载体(Lentiviral Vector)及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子药物和基因治疗领域，具体而言，利用慢病毒穿梭表达载体pLVX构建高效表达人抗体全基因的慢病毒载体表达系统，在具体应用中将不限于本研究中所使用的载体及抗体基因。此表达系统不仅在细胞水平上有很好表达抗体的效果，而且在哺乳动物体内短期就有很高的表达，本发明为慢病毒载体表达抗体全基因在抗体治疗、肿瘤治疗、干细胞治疗和新型抗体疫苗体内表达的研究提供了重要基础，也为我国新型中和抗体基因疫苗的研究提供了新方向。 

背景技术

抗体(Antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，抗体具有特异性强、副作用小、免疫原性低、生物活性单一等特点，由于其独有的特征已迅速应用于生物学和医学的很多领域。目前世界上有30多个抗体药物已经获得批准上市，主要集中在肿瘤、自身免疫性疾病和感染类疾病等方面。目前应用的抗体药物种类主要有鼠源性抗体、人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体。鼠源性抗体由于能够诱发人体产生人抗鼠抗体、半衰期短，引起过敏反应和超敏反应等缺点，影响其在肿瘤、器官移植等疾病和的诊断和治疗上的应用。人-鼠嵌合抗体和人源化抗体由于与抗原的结合能力弱，长时间使用能诱发人体产生人抗鼠抗体也使其应用受到限制，而人抗体具有更低的免疫原性、更好的安全性、更慢的清除周期，目前抗体药物的发展主要方向是向全人抗体发展。有的抗体在临床治疗比较成功，但对于抗体的广泛应用还是受到生产能力的限制，提高抗体全基因的表达效率，包括在体内的基因治疗和体外哺乳细胞的大量表达等方面都将产生重要的意义。 

当前，我国表达载体和细胞株改造都远远落后于欧美国家，所以治疗性抗体药物重点解决的问题之一是建立高效表达抗体基因的载体。抗体的基本结构相似，都是由两条相同的重链（H链）和两条相同的轻链（L链）通过二硫键连接而成，将重链和轻链构建在载体上进行高效的表达是关键所在，这样就涉及到双基因共表达的构建策略。双基因共表达的构建策略主要有以下几个方面：⑴双启动子的构建策略，这种策略是用双表达盒表达两个基因，用各自独立的启动子转录不同的基因，启动子可以一样也可以不一样，载体上有两个启动子和两个PolyA。这种构建策略的缺点是内部启动子占用了载体上有限的克隆空 间，为了增加克隆空间可以用两个启动子和一个PolyA的构建方案，这两种方案在不同的载体中转录效果也不尽相同。真核载体常用的启动子有CMV、EF-1α、hPGK、CAG、mPGK等，不同启动子有不同的转录效率，同时在不同组织中转录的效率也不尽相同；⑵引入IRES的构建策略，两个基因之间插入内核糖体插入位点(internal ribosomal entry site,IRES)序列使其为同一启动子驱动而转录为单个mRNA,但翻译为两种不同的蛋白质。这种构建方案能够避免双启动子转录时的相互干扰，但置于IRES下游基因表达量远远比上游基因表达量的效率低很多；⑶融合表达的构建策略，用连接肽(linker)将两个基因相连，在一个启动子调控下翻译出具双功能的融合蛋白分子，但对于抗体来说需要轻、重链分别表达才能组装成功能和立体结构完整的IgG。除此之外还有供体/受体位点剪切构建策略、Furin切割构建策略、2A序列自我切割构建策略等，这些构建策略由于在体内切割效率低，两基因的表达效率也很不稳定，还有部分剪切的调节机制还都不清楚。 

在抗体药物治疗和应用中，很重要的一点是要提高抗体的表达量，同时也要避免启动子相互干扰，以免造成不同基因表达水平的不一致。抗体全基因的表达，由于轻链表达量大于重链表达量才能更好更多的组装成完整的抗体，所以应该尝试多种双基因载体构建的方案，而且不同的构建方案在不同的载体在表达抗体时，其表达效率不尽相同。 

慢病毒载体包括感染灵长类动物的病毒和感染非灵长类动物的病毒，前者主要有人类免疫缺陷病毒（HIV-Ⅰ和HIV-Ⅱ）、猿免疫缺陷病毒（SIV）；后者有猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BⅣ)以及马传染性贫血病毒(EIAV)等,研究较为深入的为HIV-1。相对于其他逆转录病毒载体以及腺病毒载体来说，慢病毒载体克服了对不分裂的静止细胞不感染和表达沉默等缺陷，此外，慢病毒载体还具有可容纳较大的外源基因片段、可进行长期表达而且免疫反应小等优点，基于此，慢病毒载体的研究及应用日趋受到重视而且也取得了一定的进展。