[发明专利]乳胶半固体培养基及其制备方法和杂交瘤细胞筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，尤其是涉及一种乳胶半固体培养基及其制备方法和杂交瘤细胞筛选方法。

背景技术

抗体主要是由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞均含有合成一种抗体的遗传基因。当机体受刺激时，抗原分子上的许多抗原决定簇分别激活各个具有不同基因的B淋巴细胞。将激活的单一B淋巴细胞进行培养，得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，称为单克隆。单克隆细胞合成针对一种抗原决定簇的抗体，即单克隆抗体（简称单抗）。

1975年德国学者Kohler和英国学者Milstein将小鼠骨髓瘤细胞核经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞在体外进行两种细胞的融合，形成杂交瘤（hybridoma）细胞，这种细胞继承两种亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞无限繁殖的特性，又具有合成和分泌抗体的能力。用这种来源于单个融合细胞增殖的细胞群，可制备针对一种抗原决定簇的特异性单克隆抗体。时至今日单克隆抗体技术被不断日臻完善，但有一个问题一直困扰着单抗制备的研究人员和制约着单抗的通量化和规模化生产，即如何减少单抗制备过程中的人力成本，缩短单抗制备所需要的时间，从而降低单个单抗制备的成本。

杂交瘤细胞所分泌的抗体-单克隆抗体是目前认为的最为成熟与可靠的分子识别工具，被广泛应用于生物学研究的各个领域。然而由于杂交瘤细胞株的制备周期长，所需的劳动强度高，已经成为制约杂交瘤细胞制备的重要瓶颈之一。单抗制备过程中最重要也是最为需要人力资源的一步是分泌特异性抗体的筛选工作，好的筛选方案是单克隆抗体制备成功与否的关键，传统通用的筛选方法是通过固相酶联免疫（ELISA）法进行筛选，从成千上万个融合后的杂交瘤细胞中筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，随着制备过程的进行，有些不稳定的杂交瘤细胞失去了分泌特异性抗体的功能，在制备的末期甚至会失去全部的分泌特异性抗体的杂交瘤，导致单抗制备的失败。几十年来在筛选的方法上也存在众多的改进，如通过流式细胞仪对杂交瘤细胞所分泌的抗体进行筛选，可以筛选出亲和力较高的抗细菌膜抗原的单抗，近年来，蛋白芯片技术的不断成熟也为单抗的筛选提供了一些新的方法，Sawyer利用蛋白芯片结合多蛋白的复合免疫，进行单抗制备，取得了较好的结果。但所有这些改进，对于筛选中工作量的降低都不明显。

单抗制备过程中的另外一个需要工作量较大的部分是克隆化培养，常用的方法是有限稀释法，由于杂交瘤细胞的基因组的不稳定性，使得其在后续的培养中，会发生染色体丢失现象，即使杂交瘤细胞在建株后，仍可能会丢失编码抗体的染色体，使杂交瘤细胞失去分泌特异性抗体的能力。因此，在单抗制备初期，人们总是尽可能多的将所有阳性细胞进行克隆化培养，以期最大限度的保留分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，从而造成了巨大工作量。有限稀释法不仅劳动强度大，周期长，而且也需要很丰富的克隆筛选经验，严格把握好亚克隆的时间，操作繁琐。

发明内容

基于此，有必要提供一种使杂交瘤细胞筛选培养周期较短、操作简便的乳胶半固体培养基及其制备方法。

一种乳胶半固体培养基，包括如下体积份数的各组分：

浓度为0.4g/ml的甲基纤维素溶液                       10；

pH7.0~7.4的2×1640培养基                            18；

浓度为1mol/l的L-谷氨酰胺溶液                        0.16；

浓度为1mmol/l的β-巯基乙醇溶液                      0.5；

胎牛血清                                            10；

10000单位/ml的青霉素与10000μg/ml链霉素混合溶液     0.4；

50×HAT溶液                                         0.8；及

乳胶抗原颗粒溶液                                    1；

其中，每毫升所述乳胶抗原颗粒溶液中包括50μg的抗原、0.1ml质量分数为10%的聚苯乙烯乳胶溶液及0.9ml0.1mmol/l的磷酸盐磷酸盐缓冲液。

在其中一个实施例中，所述甲基纤维素为4000cp的甲基纤维素。

在其中一个实施例中，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4。

一种乳胶半固体培养基的制备方法，包括如下步骤：