[发明专利]乳胶半固体培养基及其制备方法和杂交瘤细胞筛选方法

权利要求书

1.一种乳胶半固体培养基，其特征在于，包括如下体积份数的各组分：

浓度为0.4g/ml的甲基纤维素溶液                              10；

pH  7.0~7.4的2×1640培养基                                 18；

浓度为1mol/l的L-谷氨酰胺溶液                               0.16；

浓度为1mmol/l的β-巯基乙醇溶液                             0.5；

胎牛血清                                                   10；

10000单位/ml的青霉素与10000μg/ml链霉素混合溶液            0.4；

50×HAT溶液                                                0.8；及

乳胶抗原颗粒溶液                                           1；

其中，每毫升所述乳胶抗原颗粒溶液中包括50μg的抗原、0.1ml质量分数为10%的聚苯乙烯乳胶溶液及0.9ml0.1mmol/l的磷酸盐磷酸盐缓冲液。

2.如权利要求1所述的乳胶半固体培养基，其特征在于，所述甲基纤维素为4000cp的甲基纤维素。

3.如权利要求1所述的乳胶半固体培养基，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH为8.4。

4.一种乳胶半固体培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

分别制备浓度为0.4g/ml的甲基纤维素溶液、pH7.0~7.4的2×1640培养基、浓度为1mol/l的L-谷氨酰胺溶液及浓度为1mmol/l的β-巯基乙醇溶液；

将抗原用0.1mmol/l的磷酸盐缓冲液稀释至100μg/ml，取质量分数为10%的聚苯乙烯乳胶用0.1mmol/l的磷酸盐缓冲液以1:5的比例稀释，然后将稀释的聚苯乙烯乳胶溶液与稀释的抗原溶液等体积混合，37℃下静置1小时，得到乳胶抗原颗粒溶液；

向所述甲基纤维素溶液中依次加入所述2×1640培养基、所述L-谷氨酰胺溶液、所述β-巯基乙醇溶液、胎牛血清、10000单位/ml的青霉素与10000μg/ml链霉素混合溶液、50×HAT溶液及所述乳胶抗原颗粒溶液，4℃下搅拌均匀得到所述乳胶半固体培养基，其中，所述甲基纤维素溶液、所述2×1640培养基、所述L-谷氨酰胺溶液、所述胎牛血清、所述10000单位/ml的青霉素与10000μg/ml链霉素混合溶液、所述50×HAT溶液及所述乳胶抗原颗粒溶液的体积比为10:18:0.16:0.5:10:0.4:0.8:1。

5.如权利要求4所述的乳胶半固体培养基的制备方法，其特征在于，所述甲基纤维素为4000cp的甲基纤维素。

6.如权利要求4所述的乳胶半固体培养基的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐磷酸盐缓冲液的pH为7.4。

7.一种杂交瘤细胞的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

按照权利要求4-6任一项所述的乳胶半固体培养基的制备方法制备所述乳胶半固体培养基；

将融合后的杂交瘤细胞于37℃下预培养16~24小时后转入所述乳胶半固体培养基中，混匀后，加入碱性成纤维细胞生长因子5ng/ml和杂交瘤细胞融合克隆因子15ul/ml，混匀，分装在37℃、5%体积的CO₂条件下培养；

培养7~14天后，待长出可见的单克隆菌落时，在体式显微镜下用微量移液器将具有颜色反应的克隆株移至多微孔板中用液体培养的方法放大培养，每孔移入1个克隆进行细胞冻存培养，即可筛选出所述杂交瘤细胞。