[发明专利]枯草芽孢杆菌fla基因编码序列及转基因植物育种方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种枯草芽胞杆菌fla基因编码序列及转基因植物育种方法，属于生物技术领域。 

背景技术

正如动物和人类的抗病能力一样，植物在长期的演化过程中，形成了许多抵抗病原生物侵袭的能力和特性，其中包括植物自身的免疫性。早在100多年前，人们就观察到对植物接种致病菌及一些病菌产物可以使植物产生对相关病害的抗病作用。自20世纪50年代以来，人们陆续发现真菌、细菌、病毒可诱导烟草、蚕豆、豇豆等多种植物产生抵抗病菌的能力。 

鞭毛是细菌的运动器官，由基体、钩形鞘和鞭毛丝等组成。其中鞭毛丝占鞭毛总长度的98％，由单一的蛋白亚单位——鞭毛蛋白构成。鞭毛蛋白两端序列高度保守，中间序列变异性高。Felix等从番茄致病菌Pseudomonas syringae pv.tabaci分离纯化了一个32kD的鞭毛蛋白，其具有能诱导番茄产生抗病反应的激发子特性。鞭毛蛋白N-端保守的22个氨基酸多肽(flg22)能诱导不同双子叶植物产生一些防御反应，因此，它似乎是一类通用激发子(GeorgFelix，1999)。 

通过筛选一些对菜豆晕斑病菌Psp非寄主抗性有所降低的拟南芥突变体得到了nho突变系，研究表明，nho1对植物非致病菌荧光假单胞菌是感病的，然而对于毒性假单胞菌不能产生抗性，说明毒性致病菌能利用某种特殊机制克服这种抗性。NHO1可被鞭毛蛋白激活，烟草假单胞杆菌由于缺少合适的鞭毛蛋白不能诱导NHO1的表达，鞭毛蛋白通过鞭毛蛋白受体(FLS2)和富含亮氨酸重复序列(Leucine-rich repeat，LRR)型类受体蛋白激酶以及丝裂素激活蛋白激酶(MAPK)参与信号传导途径从而激活植物的防御反应，因此鞭毛蛋白诱导的防御反应对非寄主抗性起重要作用。 

将细菌鞭毛蛋白基因转入植物的相关研究并不多见，多数鞭毛蛋白均克隆自病原菌，转入植物后可能会导致一些病症。YOSHIMITSU等将Acidovorax avenae的鞭毛蛋白基因转入水稻，获得了抗病的转基因水稻，且转基因水稻叶片产生积累鞭毛蛋白的褪绿斑点。而对于大多数生防菌来说，其本身无致病性，和植物存在寄生关系，和植物之间是良性互作关系。本实验室筛选的生防菌Bs-916，对水稻有诱导抗病性，其鞭毛蛋白诱导水稻抗病性的机制可能和病原菌诱导的机理不同。本发明内容即是从生防菌Bs-916中克隆了鞭毛蛋白基因fla，并将其转入水稻，从而获得了抗病植株，为水稻抗病育种提供了一个新的基因资源。 

本发明涉及的基因fla克隆自生防菌Bs-916，其关键氨基酸序列与fla22有部分同源，提示其可能与其他病原菌克隆的激发子为同一类通用激发子。因此作为其同类，fla基因可能在植物基因工程中作为目的基因有应用价值。植物基因工程是以具有明确功能的外源基因作 为目的基因，通过一定的技术路线转化植物后，随机整合到植物基因组中，使其在植物体内表达，来改善植物的抗病、抗虫和其他有益性状。如苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)杀虫蛋白(ICP)可以作为生物制剂喷洒植物进行害虫防治，基因转化棉花后，转基因棉花对棉铃虫也有抗性(AOIN63/02CN 95113498.1A)；抗菌肽(Cecropin)基因转化烟草、马铃薯和水稻后，转基因植物表现对这些植物上的细菌病害有抗性(贾士荣，1993)。通过转基因技术还可以改善作物品质如耐贮性、耐盐性、氨基酸品质和植物脂质等。但是来源于生防菌的fla基因还没有在植物转基因育种工程技术中得到应用，目前也没有有关以fla基因为目的基因的fla基因转基因育种方法的报道。 

发明内容

本发明提供了一种枯草芽胞杆菌fla基因重组载体及转基因植物育种方法。 

技术问题本发明的目的是针对枯草芽胞杆菌fla基因还没有在植物转基因育种工程技术中得到应用的现状，提供一种基因重组载体及转基因植物育种方法，将fla基因构建在植物表达的转化质粒，转化水稻获得转基因植株。其转基因植株可作为商业用途的品种、品系或作为基因资源在生产上直接使用或进行农业生物育种和转基因植物以提高作物抗病、抗虫性状和改善农作物其他生产性状。 

技术方案本发明所提供的一种枯草芽胞杆菌fla基因重组载体是通过以下方法构建而成： 

1)fla基因序列：如序列表SEQ ID NO.1所示 

2)fla基因作为目的基因构建在植物表达的Ti-质粒双元载体pCMBIA1300上：