[发明专利]一种中华蜜蜂抗菌肽AccRoyalisin多克隆抗体的制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和免疫学领域，特别地，本发明涉及一种用中华蜜蜂(Apis cerana cerana)王浆抗菌肽AccRoyalisin基因融合表达产物GST-AccRoyalisin制备的多克隆抗体。更具体地说，本发明涉及AccRoyalisin抗体的制备方法，以及用该抗体Elisa法检测中华蜜蜂、意大利蜜蜂血淋巴中Royalisin含量，作为判断蜂种或蜂群抗病力的依据；以及用该抗体Elisa法检测蜂王浆中Royalisin含量，作为评价蜂王浆防腐性能的依据。

背景技术

蜂王浆是蜜蜂头部王浆腺分泌的生物活性物质，具有促进人体生长发育，抗疲劳、提高免疫力、抗肿瘤、抗炎和抗菌等多种功能，作为人类的营养保健品历史悠久。Royalisin是蜂王浆中的一种抗菌肽，是蜜蜂受到微生物或其他外源有害物质侵染时由头部或胸部产生的一种低分子肽类。日本学者Fujiwara等（Fujiwara, S. et al. J. Biol. Chem., 1990, 265: 11333-11337）最初通过酸处理王浆，从王浆中分离获得了Royalisin，其分子量为5523 Da，其一级结构由51 个氨基酸残基组成，与蜜蜂血淋巴中的defensin序列几乎相同，仅第50位的氨基酸残基出现变化，由defensin中的精氨酸代替了王浆中Royalisin中的酪氨酸。Royalisin没有特异性，诱导产物不仅只对特定微生物，通常对其他微生物也有抗生作用。Bilikova和Bachanová等（Bilikova, K.,et al. Apidologie, 2001, 32 : 275-283; Bachanová, K., et al. Apidologie, 2002, 33 : 259-269.）对从天然王浆中分离的Royalisin进行相应的抑菌试验，证实该多肽对革兰氏阳性细菌蜜蜂幼腐病菌（Paenibacillus larvae larvae）有很强的抑菌作用，在低至1 μM的浓度下也具有抑菌作用；对革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌（Bucillus. subtilis ）和藤黄八叠球菌（Sarcina lutea），包括灰霉菌 Botrytis cinerea也有很好的抑菌作用，但对革兰氏阴性细菌无作用。

在目前全世界已报道的9个蜜蜂属（Apis）成员中，只有西方蜜蜂（Apis mellifera（其中分布最广的为意大利蜜蜂A. mellifera mellifera，简称意蜂）和东方蜜蜂(A. cerana)得到人工驯化和规模化人工养殖，并用于蜂蜜生产。相对于西方蜜蜂来说，东方蜜蜂(A.cerana)，包括我国特有的亚种中华蜜蜂(A. cerana cerana，简称中蜂)因生产性能较低，蜂群数量在原产地正处于萎缩状态。但国内外研究表明，因中华蜜蜂因长期适应于我国地理气候环境，具有西方蜜蜂所不具备的抗病性、耐寒性等抗逆性能，其生物学特点也非常不同于前者，在蜜蜂育种和生态多样性保护等方面具有非常重要的利用价值。因为抗菌肽在蜜蜂的自身防御系统里起着不可替代的作用。蜂螨和近年来爆发的蜜蜂崩塌病对西方蜜蜂危害十分严重, 蜂病防治受到各国的高度重视, 很多蜜蜂专家已在选育抗病品种作为最重要的防治手段方面开展了大量研究。近年国内学者（Xu, P., et al . PLoS ONE. 2009, 4: 1-9.）研究表明，包括中华蜜蜂亚种在内的东方蜜蜂（Apis cerana）之所以抗病性优于意大利蜜蜂在内的西方蜜蜂，与其分泌抗菌肽能力强、种类多密切相关。

目前国际上已发现的抗菌肽分为四大类: (a) cecropins, (b) defensins 或sapecins, (c) attacin-like proteins,(d) proline-rich peptides。Defensins是昆虫抗菌肽中最多的一类，它包括了三个亚类：精典defensins, β-defensins 和昆虫defensins。Royalisin属于昆虫 defensins亚类。昆虫 defensins亚类一般由36-51个氨基酸残基组成，三对二硫键，一个α-折叠、两个β折叠和一个N-端环组成的稳定结构，均具有抗革兰氏阳性细菌的活性 (Cho, W. L., et al Insect Biochem. Molec. Biol. 1996, 26: 395-402)。