[发明专利]基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种rRT-PCR检测技术，具体涉及一种基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针、试剂盒及检测方法。 

背景技术

流感病毒基因组由8条（甲、乙型）或者7条（丙型）负链RNA节段构成。根据病毒的核蛋白（NP）和基质蛋白（M）不同分为甲型、乙型、丙型。丙型流感病毒广泛分布于自然界，偶能引起局部地区和学校暴发。 

丙型流感病毒普遍感染健康人群，婴儿出生时由母体带来的抗体，在6个月时基本消失。从1岁起，个体血清阳性百分比逐渐增加，大约在20～30岁达到最高水平。根据日本调查，所有10岁儿童基本上都有丙型流感病毒抗体。 

丙型流感病毒跟A型流感病毒一样，能引起婴儿和老人流涕、发烧（腋下体温≥38℃），出现感冒症状。中国曾于1981年和1982年由郭元吉教授在猪群中分离到2株丙型流感病毒，但中国到目前为止人群中没有丙型流感病毒的监测数据。日本对丙型病毒的监测比较完善，通过RT-PCR检测，人群感染丙型流感病毒的阳性率高达2.5％，可见丙型流感病毒的感染率并不比甲型和乙型的阳性率低。 

丙型流感病毒可以通过鸡胚或者细胞分离，但分离率比较低，灵敏度不高。已有的普通RT-PCR检测技术容易引起环境污染，检测灵敏度低，易导致假阳性结果，不适于临床标本的快速检测和鉴定。另外鉴定病毒还可以通过基因测序的方法，但耗时长，成本高，普通实验室难于完成。因此，目前尚无一种快速、灵敏的方法用于检测丙型流感病毒及其变异株。 

上述现有技术至少存在以下缺点： 

（1）操作费时、成本高； 

（2）对实验室的软硬件要求也比较高。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、应用方便的基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂克服现有技术中常规基因测序的方法，耗时长，成本高且对实验室软硬件要求高的缺陷。 

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针，包括丙型流感病毒特异性引物和探针， 

所述丙型流感病毒特异性引物和探针包括丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针、丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针、丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针及丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针中的一种或任意几种； 

所述丙型流感病毒特异性引物和探针针对流感病毒HE基因相对保守区域、丙型流感病毒NP基因相对保守区、针对丙型流感病毒MP基因相对保守区和/或针对丙型流感病毒NS基因相对保守区； 

所述丙型流感病毒特异性引物和探针是长度为18～27bp的寡核苷酸片段； 

其中，针对HE基因和MP基因的探针与目的基因负链的碱基序列一致，针对NP基因和NS基因的探针与目的基因正链的碱基序列一致。 

本发明的有益效果是：本发明基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针，由于包括针对流感病毒HE基因相对保守区域；针对丙型流感病毒NP基因相对保守区、针对丙型流感病毒MP基因相对保守区所述丙型流感病毒NS基因和/或针对丙型流感病毒NS基因相对保守区引物和探针，可以通过rRT-PCR法检测丙型流感病毒，操作简单、应用方便。 

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。 

进一步，所述丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针为： 

正向引物（SEQ ID NO.1）：5'-YGGAGGAAATTTRTATGC-3'， 

反向引物（SEQ ID NO.2）：5'-GCCRATCCATGTACTTTG-3'， 

探针（SEQ ID NO.3）：5'-FAM-TTCAAGACRGARGCTCCAGC-BHQ1-3'； 

所述丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针为： 

正向引物（SEQ ID NO.4）：5'-RAGGGAAAAGAAAGCAAG-3'， 

反向引物（SEQ ID NO.5）：5'-CTGCRTGGTAGGTTATATTG-3'， 

探针（SEQ ID NO.6）：5'-FAM-AGCRGACAGYAACTTCAACGC-BHQ1-3'； 

丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针为： 

正向引物（SEQ ID NO.7）：5'-GACCACAATTATGCCTGAA-3'，