[发明专利]基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂

权利要求书

1.基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针，包括丙型流感病毒特异性引物和探针，其特征在于，

所述丙型流感病毒特异性引物和探针包括丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针、丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针、丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针及丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针中的一种或任意几种；

所述丙型流感病毒特异性引物和探针针对流感病毒HE基因相对保守区域、丙型流感病毒NP基因相对保守区、针对丙型流感病毒MP基因相对保守区和/或针对丙型流感病毒NS基因相对保守区；

所述丙型流感病毒特异性引物和探针是长度为18～27bp的寡核苷酸片段；

其中，针对HE基因和MP基因的探针与目的基因负链的碱基序列一致，针对NP基因和NS基因的探针与目的基因正链的碱基序列一致。

2.根据权利要求1所述基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测引物和探针，其特征在于，

所述丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针为：

正向引物（SEQ ID NO.1）：5'-YGGAGGAAATTTRTATGC-3'，

反向引物（SEQ ID NO.2）：5'-GCCRATCCATGTACTTTG-3'，

探针（SEQ ID NO.3）：5'-FAM-TTCAAGACRGARGCTCCAGC-BHQ1-3'；

所述丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针为：

正向引物（SEQ ID NO.4）：5'-RAGGGAAAAGAAAGCAAG-3'，

反向引物（SEQ ID NO.5）：5'-CTGCRTGGTAGGTTATATTG-3'，

探针（SEQ ID NO.6）：5'-FAM-AGCRGACAGYAACTTCAACGC-BHQ1-3'；

丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针为：

正向引物（SEQ ID NO.7）：5'-GACCACAATTATGCCTGAA-3'，

反向引物（SEQ ID NO.8）：5'-TGGTGAGTTGTCGGTTTC-3'，

探针（SEQ ID NO.9）：5'-FAM-TCTCCCAGGTCAAGTCTCTCCC-BHQ1-3'；

丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针为：

正向引物（SEQ ID NO.10）：5'-CGTAGAAATGAAGGGRAAG-3'，

反向引物（SEQ ID NO.11）：5'-CTCCACGATGATGATACA-3'，

探针（SEQ ID NO.12）：5'-FAM-CTCCAAGCAACATAGCACCAATT-BHQ1-3'。

3.基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括检测溶液，其特征在于，所述检测溶液包括权利要求1或2所述的丙型流感病毒HE基因特异性引物和探针、丙型流感病毒NP基因特异性引物和探针、丙型流感病毒MP基因特异性引物和探针及丙型流感病毒NS基因特异性引物和探针中的一种或任意几种。

4.基于多基因的丙型流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法，包括以下步骤：

（1）利用核酸提取试剂从待测样本中提取流感病毒RNA，得到流感病毒RNA溶液；

（2）反应体系：总体积25ul,取5ul步骤（1）制得的病毒RNA溶液，12.5ul2×RT-PCR Buffer,1ul25×RT-PCR Enzyme Mix,加入针对丙型流感病毒HE基因和/或丙型流感病毒NP基因和/或丙型流感病毒MP基因和/或丙型流感病毒NS基因的检测上游引物分别为0.5uL及下游引物分别为0.5uL，浓度均分别为40uM和探针0.5uL，浓度均分别为20uM，RNase Free H₂O加至25ul；

（3）步骤（2）反应体系按下述条件进行rRT-PCR检测：

45℃/10min，1个循环，95℃/10min,1个循环，95°/15s,60°/45s，40个循环；每次循环的退火时收集荧光，检测结果，根据扩增曲线和Ct判定结果。