[发明专利]一种可提高基因转染效率的纳米粒子和基于该粒子的基因转染试剂的制备

说明书

技术领域：

本发明涉及一种生物体自然产生的纳米粒子(NONPs)，通过掺杂的方式制备高效率的基因转染试剂。

背景技术：

基因转染是真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程，可用于生产基因制品如蛋白质，RNA，抗体等；或将控制基因引入细胞用以调节内在基因/酶的功能用于细胞生物学研究；或修复丢失/损坏的基因用于基因疗法。基因转染技术不仅是研究转基因和基因表达的重要工具，而且是目前基因治疗的关键步骤。理想的基因转染试剂应该具有如下特点：高效转染；安全；低细胞毒性；方法简单；省时、经济。

目前，主要的基因转染试剂为病毒型转染试剂与人工合成型转染试剂。病毒型转染试剂虽具有整合效率高、可使外源基因在宿主细胞中长期表达等优点，但是由于其基因携带能力有限，缺乏靶向性，易产生免疫源性，且操作危险(Putnam，D.Nat Mater 5，439-451，2006)，因此人们更倾向于使用人工合成型的基因转染试剂。目前人工合成型基因转染试剂主要是阳离子脂质体类、阳离子肽类和阳离子聚合物类，或者是上述几种的复合物。然而，当前的人工合成型基因转染试剂同病毒型试剂相比，仍然具有较低的转染效率，并且毒性高。这在很大程度上限制了它的应用(Mastrobattista，E.，et.al.Nat Rev Drug Discov 5，115-121，2006)。但这同时也说明，人工合成转染制剂在基因转染表现上还有很大的可提升空间。高效率、低毒性的基因转染试剂的研发目前是国际上的热门课题。

自然产生的纳米粒子(NONPs)在生物体系以及细胞体外循环系统中广泛存在。目前已经有多种NONPs被发现并命名，比如外来体(膜性囊泡)、脱落囊泡、宏粒子、多泡体等等。近期，这些纳米粒子在药物传递和基因治疗上开始引发科学家和研究者的浓厚兴趣。虽然这些粒子的性质和功能还未被研究透彻，但是他们在细胞通讯方面起着重要作用已经得到广泛认同。

发明内容：

本发明的目的是克服现有人工合成转染试剂转染率低的不足，提供一种可提高基因转染试剂转染率的纳米粒子(NONPs)，以及使用该粒子制备新型基因转染试剂的方法。

可提高转染效率的纳米粒子(NONPs)可以从牛奶但不仅限于从牛奶中纯化得到。该NONPs有以下特性：小于200nm的尺寸，如图1；表面带有负电荷。由于其表面负电荷，因此不会使DNA发生绑定或者凝结，如图2。通过添加NONPs得到的基因转染试剂具有高效率、低毒性的特点。

根据文献，制备NONP溶液的简化步骤如下：

1.经过筛选之后，采用低速离心过滤发去除大粒子，如细胞、大的细胞碎片等；

2.高速离心过滤法去除生物分子，如蛋白质、核苷酸等；同时制成球状NONPs；

3.将纯化的NONPs溶解水、或盐水溶液、或细胞培养液、或磷酸盐缓冲液(PBS)、或二甲基亚砜(DMSO)、或二甲基甲酰胺(DMF)、或甘油，或以上以一种或几种的混合液中。采用上述方法，1ml的NONP溶液可通过处理250ml牛奶得到。

基于上述NONPs的基因转染试剂的制备方法，是将该NONPs以及目前常用的基因转染试剂分散于溶剂中，该溶剂含有水、磷酸盐、或细胞培养液等。步骤如下：

pEGFP DNA质粒0.5μg、定量PEI(0.1％，2μl)以及NONPs 4μL混合后溶解入磷酸盐缓冲盐水(PBS)制作成100μL溶液。室温下培养30分钟，即可用于细胞的转染。

附图说明：

图1.自然产生的纳米粒子NONPs的原子力分析图，标尺为500nm。

图2.1-4列为PEI/DNA带移分析图，5-7列为PEI/NONP/DNA带移分析图。对应列(1)N/P＝0；(2)N/P＝8；(3)N/P＝16；(4)N/P＝0；(5)N/P＝0；(6)N/P＝8；(7)N/P＝16。样品分别为NONP：4μL，DNA：100ng，对应实施例1和实施例2。

图3.(a)为PEI-DNA复合物原子力显微镜结构图，标尺为500nm；(b)为PEI/NONP/DNA复合物的原子力显微镜结构图，标尺为500nm。

图4.(a)为H293T细胞在PEI/NONP/DNA体系中转染48后(N/P＝32)的荧光粉显微镜图；(b)为H293T细胞在PEI/DNA体系中转染48后(N/P＝32)的荧光粉显微镜图。