[发明专利]5（6）-羧基荧光素异构体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光素异构体的制备方法，具体涉及5-羧基荧光素和6-羧基荧光素两个异构体的制备和分离。

背景技术

自从Southern于1975年首次开发了DNA探针杂交技术以来,该技术已经被广泛应用于分子生物学、分子遗传学和临床医学等学科领域,进行核酸的定性、定量检测和基因疾病诊断.在该技术的实际应用中,核酸探针的制备与标记是其中的重要一步,影响该技术的实际应用与发展.核酸探针的标记有同位素标记和非同位素标记两大类,荧光标记法是一种非同位素标记,因其灵敏度高,且不存在环境污染以及放射性废物处理等问题,已成为目前关注的热点。

目前用于标记的荧光探针染料主要有荧光素类、罗丹明类、邻苯二甲醛类等化合物.其中荧光素及其衍生物在生物领域的研究中占有极其重要的位置,

一直是化学及生物分析领域研究的热点。荧光素具有羟基、羧基等活性官能团,容易与被标记化合物，如蛋白质、核酸的-NH2、-SH、-COOH发生反应形成共价键,因而所得标记物具有高选择性、高稳定性和高灵敏性的优点。荧光素类化合物一方面因其具有高的摩尔吸光系数,激发和发射波长都在可见光区,在水中有较高的荧光量子产率,无毒,成本低等优点而被广泛应用于核酸探针、研究蛋白质结构特性及标记抗体等方面。荧光素类似物的典型制备方法是通过间苯二酚类化合物与相应的邻苯二甲酸、苯甲醛衍生物或者相应的酚与2-(2,4-二羟基苯甲酰)苯甲酸衍生物反应制备.另外也可以通过对荧光素进行结构修饰,引入活性基团,以改善其与被标记分子的特异性结合,提高灵敏性和选择性.

但现有能用于生物大分子标记的荧光染料并不多，主要原因是很多荧光染料或者荧光强度不够高，或者稳定性不够好。荧光素染料应用较为常见，但这类染料因为有5-和6-位羧基异构体，制备时一般同时生成，较难分离。但异构体的混合物在用于定量时由于两个异构体的最大吸收和发射波长有不同，会导致谱带变宽，且混合物中两个异构体的比例难以控制，会导致定量的不准确，故5-和6-位羧基异构体混合物直接应用的限制性是显而易见的，有必要将5-和6-位羧基异构体分离出来。

荧光素异构体的分离方法，目前文献报导有四种：

1、衍生物法，衍生成二氯-5(6)-羧基荧光素二新戊酸酯或二特戊酰酯等，利用两个异构体衍生物的溶解度不同用重结晶方法分离，最后脱去修饰基团（彭正红等，染料与染色，2004年第2期，93~94），但该法比较繁琐，成本较高。

2、当反应在甲磺酸中进行，会生成甲磺酸基2’,7’-二氯-5（6）-羧基荧光素中间体，该中间体分段结晶，可分别甲磺酸基2’,7’-二氯-5-羧基荧光素和甲磺酸基2’,7’-二氯-6-羧基荧光素，进一步依次用氢氧化钠和盐酸处理得到2’,7’-二氯-5-羧基荧光素和2’,7’-二氯-6-羧基荧光素(Yuichiro Ueno等，synthesis,2004,2591~2593)。但该中间体甲磺酸基2’,7’-二氯-5（6）-羧基荧光素吸湿性很强，能与水甲醇乙醇等形成溶剂化合物，含水量极高，极难干燥，水合物并不能重结晶分离异构体。

3、制备色谱法，但受设备仪器的限制，能处理的样品量有限(葛凤燕等，化学通报，2009年第1期，78~81)，不能规模制备。

4、有报导用采用柱色谱,以V_无水乙醇/V_氨水=20/1为洗脱液成功地将5-和6-羧基荧光素分离(葛凤燕等，化学通报，2009年第1期，78~81)。但洗脱液中含一定量的水份，反复洗脱后，硅胶填料会含水量过高部分溶解发生柱坍塌等，因此影响分离，而且效益不高。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提出一种可用于生物大分子标记定量的荧光染料的新的制备方法，能有效地提高收率，简化工艺和提高荧光染料质量，有力推动荧光素在分子标记方面的应用。

本发明的上述目的是通过下述的技术方案实现的：

A.间苯二酚和1，2，4-苯三酸酐在甲基磺酸中，100℃反应生成甲磺酸基5（6）-羧基荧光素；

B.甲磺酸基5（6）-羧基荧光素用先后用氢氧化钠处理为5（6）-羧基荧光素二钠；

C.5（6）-羧基荧光素二钠用盐酸处理为5（6）-羧基荧光素；

D.5（6）-羧基荧光素用柱层析分离异构体得到5-羧基荧光素和6-羧基荧光素。

本发明的优选方案为，所述的荧光染料新的制备方法中，所述的柱层析方法为硅胶柱层析方法；