[发明专利]青枯病菌培养基及青枯病菌电激感受态细胞的制备方法

权利要求书

1.一种青枯病菌培养基，其特征是，固体，每1升培养基中，各组分及含量为：500克新鲜马铃薯浸出液；Ca(NO₃)₂.4H₂O 1.0克；Na₂HPO₄.12H₂O 2.0克；蛋白胨5.0克；酵母浸出物1克；蔗糖15克；琼脂15克。

2.根据权利要求1所述的青枯病菌培养基，其特征是，pH值6.8。

3.根据权利要求1或2所述青枯病菌培养基的制备方法，其特征是，步骤如下：

（1）取新鲜马铃薯（优选的，所用新鲜马铃薯为500克）切丁（优选1厘米见方的丁），放到盛有蒸馏水的烧杯（优选盛有800毫升蒸馏水的1升烧杯）中加热至沸腾后，自然冷却至室温，用尼龙网（优选200目的尼龙网）过滤得马铃薯浸出液，弃掉马铃薯块；

（2）将Ca(NO₃)₂.4H₂O、Na₂HPO₄.12H₂O、蛋白胨、酵母浸出物、蔗糖依次加入到马铃薯浸出液中，用蒸馏水定容到1升，调节pH值至6.8（优选的，用盐酸或氢氧化钾调节pH值）；

（3）用三角瓶（优选500毫升的三角瓶）进行分装（优选的，各取200毫升培养基进行分装）为5瓶，每瓶加入琼脂3克，制作成固体培养基。

4.一种青枯病菌培养基，其特征是，液体，每1升培养基中，各组分及含量为：500克新鲜马铃薯浸出液；Ca(NO₃)₂.4H₂O 1.0克；Na₂HPO₄.12H₂O  2.0克；蛋白胨5.0克；酵母浸出物1克；蔗糖15克。

5.根据权利要求3所述的青枯病菌培养基，其特征是，pH值6.8。

6.根据权利要求4或5所述青枯病菌培养基的制备方法，其特征是，步骤如下：

（1）取新鲜马铃薯（优选的，所用新鲜马铃薯为500克）切丁（优选1厘米见方的丁），放到盛有蒸馏水的烧杯（优选盛有800毫升蒸馏水的1升烧杯）中加热至沸腾后，自然冷却至室温，用尼龙网（优选200目的尼龙网）过滤得马铃薯浸出液，弃掉马铃薯块；

（2）将Ca(NO3)2.4H2O、Na2HPO4.12H2O、蛋白胨、酵母浸出物、蔗糖依次加入到马铃薯浸出液中，用蒸馏水定容到1升，调节pH值至6.8（优选的，用盐酸或氢氧化钾调节pH值）；

（3）用三角瓶（优选500毫升的三角瓶）进行分装（优选的，各取200毫升培养基进行分装）为5瓶。

7.一种青枯病菌电激感受态细胞的制备方法，其特征是，步骤如下：

（1）将权利要求1或2所述固体培养基、权利要求4或5所述液体培养基、培养皿、10%甘油500毫升、10毫升离心管、50毫升离心管、1.5毫升离心管高温灭菌，灭菌结束后，放到无菌超净工作台备用；

（2）取出青枯病菌菌株在固体培养基上划线，30℃培养48小时；

（3）挑取2个单菌落，分别加入到盛有1毫升液体培养基的10毫升离心管中，在水浴摇床中以30℃ 260rpm进行培养6小时；

（4）将培养的1毫升菌液加入到200毫升的液体培养基中，在水浴摇床中以30℃ 300rpm进行培养,10小时后用可见光分光光度计监测550纳米下吸光值OD550，等到吸光值OD550为0.57时立刻把三角瓶从水浴中取出，放到冰水混合物中进行冷却约15分钟；

（5）将冷却的菌液分装到50毫升离心管中，4℃ 2400g离心10分钟；

（6）弃掉上清液，加入30毫升10%预冷的甘油，盖上盖子后重新悬浮菌体；

（7）4℃ 2400g离心10分钟，弃掉上清液，加入30毫升10%预冷的甘油，盖上盖子后重新悬浮菌体；

（8）4℃ 2400g离心10分钟，弃掉上清液，加入1毫升10%预冷的甘油，重新悬浮菌体，分装到1.5毫升离心管中，每个离心管分装50微升，置超低温冰箱中保存待用。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征是，步骤（1）的灭菌条件为121℃，15分钟。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征是，步骤（8）超低温冰箱温度为-80℃。