[发明专利]壳聚糖酶的纯化、基因克隆及其酶学特性的鉴定

说明书

技术领域

本发明涉及一株革兰氏阳性杆菌，该菌分泌一种壳聚糖酶，特别涉及对该壳聚糖酶的纯化、基因克隆及其酶学特性的鉴定。

背景技术

几丁质(chitin)主要是N-乙酰葡萄糖胺通过β-1，4-糖苷键形成的链状多聚物，主要存在于水生甲壳动物、软体动物和节肢动物的外壳中(如虾、蟹等)，每年产量超过10亿吨，仅次于纤维素，是一类丰富的自然资源。但几丁质不溶于常用溶剂，直接利用非常困难。将丁质用碱液处理后得到脱乙酰基产物(脱乙酰度为65％～99％，以70％～80％最常见)，即壳聚糖(chitosan)。壳聚糖在自然界中也存在，主要在一些真菌和一些绿藻的细胞壁中。但目前生产中应用的壳聚糖基本上是几丁质的脱乙酰化产物。与几丁质相比，壳聚糖可溶于酸性溶剂并带正电荷，可用于食品、制药、纺织、污水处理等行业。壳聚糖可进一步通过化学法或酶法降解成壳寡糖(一般由几个到十几个糖残基组成)。壳寡糖的水溶性好，而且具有多种生物活性，例如可以抑制细菌和真菌生长，具有抗肿瘤与调节免疫活性，可增强植物抗病性等。所以壳寡糖的研究近年来受到越来越多的重视，可能成为一个新兴产业。

壳聚糖酶(chitosanase，EC 3.2.1.123)可以水解壳聚糖中的β-1，4-糖苷键，将壳聚糖降解。已发现的壳聚糖酶绝大部分为内切酶，可以将壳聚糖降解为壳寡糖。目前研究最多的是来源于细菌和真菌的壳聚糖酶。相对于化学水解法，利用壳聚糖酶酶解生产壳寡糖有其独特的优势，例如壳寡糖的得率高，对环境污染小等。但其前提是要开发出廉价的壳聚糖酶，所以寻找合适的壳聚糖酶对酶解法生产壳寡糖非常重要。

发明内容

本发明的目的在于得到了一株革兰氏阳性杆菌，该菌分泌一种壳聚糖酶，能够降解壳聚糖得到壳聚二糖和壳聚三糖。

我们从被污染的酵母培养液中分离到一杂菌，为革兰氏阳性杆菌，其分泌的主要蛋白产物，经分离纯化后，测定其N-端氨基酸序列与已知的几种壳聚糖酶极相似，据此克隆了其全长基因，并研究其酶学性质。该酶能快速高效地将壳聚糖降解为壳寡糖，由于该杆菌生长快，主要分泌产物为壳聚糖酶，有望用于壳寡糖的生产。

附图说明

图1：Bacillus sp.TK-02革兰氏染色。

图2：SDS-PAGE分析发酵上清(A)和纯化产物(B)：M为蛋白分子量标准；

Sup为发酵上清；1为初步纯化产物；2为二次纯化产物。

图3：HPLC进行纯度鉴定结果。

图4：电喷雾质谱进行分子质量测定结果。

具体实施方式：

实施例1：

壳聚糖酶生产菌株的培养：我们从被污染的酵母培养液中分离到一杂菌，革兰氏染色以及形态观察表明它是一种革兰氏阳性杆菌(图1)，暂命名为Bacillussp.TK-02。该菌株先在LB固体培养基上培养过夜(30℃)，然后挑取单克隆接种于LB液体培养基中于30℃震荡培养24h。将菌液离心(5000g，10min)，收集上清。

实施例2：

壳聚糖酶的纯化与N-端氨基酸序列测定：该菌发酵液上清组成相对简单，分泌表达产物主要为该壳聚糖酶(图2A)。将培养液上清浓缩后进行分离纯化，首先用疏水层析的方法将该壳聚糖酶从大体积的发酵液上清中分离出来，SDS-PAGE鉴定表明该步纯化得到的壳聚糖酶主要含有一种分子质量较大的杂蛋白(图2B，lane 1)。据此，再通过分子筛进行纯化，便得到了高纯度的壳聚糖酶(图2B，lane2)。该壳聚糖酶的纯度进一步用C3反相HPLC进行鉴定。如图3所示，该酶在HPLC上只有一个峰，其纯度大于95％。洗脱的壳聚糖酶用电喷雾质谱测定其分子质量(图4)：测定的分子质量(44017u)与预期的分子质量(45780u)有较大出入，测定的分子质量比理论值小1763u。分析该壳聚糖酶的C端序列发现其含有双碱性氨基酸(KK)，推测纯化到的该壳聚糖酶在该双碱性氨基酸处被剪切，由此得到的壳聚糖酶的理论分子质量为44040u，与测定的分子质量基本相符，误差仅千分之一左右。

在SDS-PAGE上得到单一蛋白条带，其测定的N-端氨基酸序列为：AAAKEMKPFPQQ。通过网上蛋白质序列检索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，找到11条相同的序列，它们都是壳聚糖酶，而且全部来源于杆菌属(Bacillus)。根据壳聚糖酶活力测定，我们推测纯化到的蛋白是一种壳聚糖酶。

实施例3：