[发明专利]一种齐考诺肽及其杂质的检测方法

权利要求书

1.一种分离和分析齐考诺肽及各杂质的方法，包括： 

在柱色谱法中，将分别以缓冲液与有机溶剂按不同比例配制的流动相A和流动相B按不同比例混合作为流动相，梯度洗脱含齐考诺肽及各杂质的样品， 

其中所述流动相A为含有0-15体积％有机溶剂的缓冲液溶液，所述流动相B为含有40-60体积％缓冲液的有机溶液; 

其中所述齐考诺肽及各杂质结构如下： 

1）齐考诺肽 

Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2,二硫键:1-16,8-20,15-25； 

2）杂质A 

H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asn-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫键:1-16,8-20,15-25； 

2）杂质B 

H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-D-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫键:1-16,8-20,15-25； 

3）杂质C 

D-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫键:1-16,8-20,15-25； 

4）杂质D 

H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-γ-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫键:1-16,8-20,15-25； 

5）杂质E 

H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-D-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫键:1-16,8-20,15-25； 

6）杂质F 

H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-D-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫键:1-16,8-20,15-25。 

2.权利要求1所述的方法，其中所述柱色谱法的色谱柱填料为十八烷基键合硅胶填料。 

3.权利要求1所述的方法，其中所述流速为0.8-1.2ml/min；优选地，所述流速为1.0ml/min。 

4.权利要求1所述的方法，其中所述有机溶剂选自下列化合物：甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇；优选地，所述有机溶剂为乙腈与甲醇；更优选地，所述有机溶剂为乙腈。 

5.权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液指由磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠或磷酸氢二铵水溶液；优选地，所述缓冲液为磷酸二氢钾和磷酸二氢钠；更优选地，所述缓冲液为磷酸二氢钾。 

6.权利要求5所述的方法，其中所述缓冲液的pH为至6-7；优选地，所述缓冲液的pH为6.2-6.8；更优选地，所述缓冲液的pH为6.5。 

7.权利要求5或6所述的方法，其中所述缓冲液的浓度为2mmol/L-50mmol/L；优选地，所述缓冲液的浓度为10-30mmol/L；更优选地，所述缓冲液的浓度为20mmol/L。 

8.权利要求1所述的方法，其中所述流动相A为含有0–15％的权利要求4所述有机溶剂的缓冲液溶液；所述流动相B为含有0-45％的权利要求5所述的缓冲液的有机溶液。 

9.权利要求8所述的方法，其中所述流动相A为乙腈:缓冲液=10:90)的溶液，流动相B为含缓冲液:乙腈=50:50的溶液。 

10.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述梯度为： 

0-25分钟时间段内，流动相A和流动相B混合后的流动相中有机溶剂比例为5-20％，优选11.5-18%，例如11.5%、12%、13.6%、14%、16%和18%，更优选14-16%，在此期间有机溶剂的比例可以是变化的，例如匀速增加的，或者可以是不变的； 

在25-40分钟时间段内，改变流动相A和流动相B的混合比例逐渐将有机溶剂比例增加至25％-35％，并保持10分钟，优选27-32.5%， 例如27%、28%和32.5%，更优选28%； 

在50-55分钟时间段内，改变流动相A和流动相B的混合比例逐渐将有机溶剂比例降回5-15％，优选11.5-14%，例如11.5%、12%、14%和15%，更优选14%； 

优选地，所述增加或减少均为匀速增加或减少。