[发明专利]一种验证二硫键对木聚糖酶热稳定性影响的方法

说明书

技术领域

本发明涉及源自11家族耐热杂合木聚糖酶AEx11A结构的同源建模及其与AoXyn11A结构的比对分析，突变木聚糖酶AEx11A^C5T工程菌的构建以及突变木聚糖酶的高效表达、纯化和活性测定的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是一类重要的工业用酶。它主要是作用于木聚糖主链，随机地切开木聚糖内部的木糖苷键，水解产物主要为不同聚合度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶中最关键的酶。近几年，由于木聚糖酶在饲料工业、食品加工及酿造等行业具有潜在的工业应用和经济价值，尤其是在工业造纸上的应用，减少因漂白产生的环境污染，受到了越来越多的关注。然而在许多工业中，木聚糖酶都需要在高温条件下进行操作，因此对木聚糖酶热稳定性的研究也引起了国内外研究的高度重视。

根据木聚糖酶催化区域的结构和性质分析，可将其分为不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。由于11家族的木聚糖酶分子量较小，且结构比较简单，更适合作为理论研究的分子模型。许多研究结果表明11家族木聚糖酶的N末端区域对其稳定性起着很重要的作用。Lee等人对木聚糖酶XynA的N端进行删除突变，突变酶的热稳定性丧失但活性不变，从而确定了N端是其热稳定区，卢雪丽等人引入二硫键提高黑曲霉XynIII热稳定性的研究。但N端二硫键对11家族耐热杂合木聚糖酶AEx11A的热稳定性分析未见有文献或专利报告。本发明能为11家族木聚糖酶AEx11A的热稳定机制的阐明、热稳定性蛋白工程的改造等奠定理论基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型地利用计算机和生物信息学知识，对11家族木聚糖酶AEx11A结构的同源建模及其与AoXyn11A结构的比对分析，运用基因工程的方法构建突变木聚糖酶工程菌以及突变木聚糖酶的高效表达、酶活性、最适温度的测定方法。

本发明的技术方案：一种源自11家族木聚糖酶AEx11A结构的同源建模及其与AoXyn11A结构的比对分析后，得出在端引入了一个二硫键(Cys⁵-Cys³²)，利用定点突变法将5位的半胱氨酸突变为苏氨酸(C5T)突变前后的基因分别为AEx11A和AEx11A^C5T。AEx11A^C5T基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

11家族木聚糖酶pPIC9K-AEx11A由江南大学医药学院分子生物学实验室制备和保藏。

所述的由完整mRNA序列推导的AEx11A^C5T氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

所述的突变木聚糖酶的活性测定方法：

于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 4.6、柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液配制的质量浓度为0.5％的桦木木聚糖(Sigma，USA)溶液2.4mL，50℃预热10min，在A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应15min；立即各加入2.5mL 3′，5′-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖(以木糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个木聚糖酶活性单位(IU)。

所述的突变酶的最适温度和热稳定性的测定：

在不同温度下，按上述方法测定酶活性，以最高酶活性为100％计算相对酶活性。T_opt表示最适温度。将酶液置于不同温度下保温不同时间，按上述方法测定残余酶活性，以未处理的酶活性为100％。t_1/2^A表示在A℃下酶的半衰期，即残余酶活性为50％时的保温时间。

所述的突变木聚糖酶基因的设计、克隆及表达：