[发明专利]一种验证二硫键对木聚糖酶热稳定性影响的方法

权利要求书

1.一种对来源于米曲霉Aspergillus oryzae的11家族的杂合木聚糖酶AEx11A进行耐热分析。通过对AEx11A结构的同源建模及其与AoXyn11A结构的比对分析，定向突变以研究热稳定提高的原因，突变后的核苷酸(AEx11A^C5T)序列为SEQ ID NO：1。

2.由权利要求1所述的突变的木聚糖酶基因(AEx11A^C5T)编码的突变木聚糖酶(AEx11A^C5T)，其完整的氨基酸序列对应于序列表中的为SEQ ID NO：2。

3.AEx11A结构的同源建模及其与AoXyn11A结构的比对分析：

同源建模AEx11A的空间结构：登录蛋白质结构数据库Protein data bank(http://rcsb.org)，经BLAST比对，找到与AEx11A一级结构具有高度同源的，分别来自绳状青霉菌Penicilliumfuniculosum(1TE1)、E.coli(2VUL)和红褐肉座菌Hypocrea jecorina(1ENX)的11家族木聚糖酶晶体结构，作为同源建模的模板；其相似性分别为63.7％、78.8％和60.9％。利用SALIGN(http://salilab.org/DBAli/？page＝tools_&action＝f_salign)和MODELLER 9.9(http://salilab.org/modeller/)程序对AEx 11A进行同源建模；

经比对发现由于N端替换，在AEx11A分子结构中引入了一个二硫键(Cys⁵-Cys³²)，其连接两个反向平行的β-折叠股(A1和A2)，可能会通过降低蛋白质解折叠状态的熵，而对其热稳定性提高有一定的作用。

4.突变木聚糖酶工程菌的构建和表达方法：

(1)突变基因AEx11A^C5T及表达质粒的构建

根据pPIC9K-AEx11A(本实验是保存)设计引物，将其中的Cys⁵突变为Thr⁵

F1：5′-GA ATTCAACGCTCAAACTactCTTACCTCT-3′，含EcoR I酶切位点和突变点Thr⁵

R1：5′-GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAATAGCAG-3′，含Not I酶切位点

以pPIC9K-AEx11A为模板，以F1和R1为引物进行PCR反应。94℃2min；30个循环，94℃30s，55℃30s，72℃40s；72℃10min。将PCR的目的条带进行克隆、测序；测序正确的pUCm-T-AEx11A^C5T与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-AEx11A^C5T，并对重组质粒进行测序鉴定；

(2)GS115/AEx11A^C5T的构建、表达、产物纯化及活性测定

用Sal I对pPIC9K-AEx11A^C5T进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/AEx11A^C5T；该工程菌用1.0％甲醇诱导72h，DNS法测得发酵液中突变木聚糖酶活性与原酶AEx11A基本一致。发酵液经离心后的上清液为突变AEx11A^C5T粗酶液，经截留分子量为10kDa的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示突变木聚糖酶分子量与原酶AEx11A基本一致；该突变木聚糖酶最适作用温度60℃，低于原酶AEx11A的最适温度85℃；其t_1/2⁷⁰和t_1/2⁸⁰分别为3.0、1.0min低于原酶AEx11A的197和25min。