[发明专利]一种LKB1mRNA检测方法、试剂盒及基因芯片

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种LKB1mRNA检测方法、试剂盒及基因芯片。

背景技术

人LKB1（Liver Kinase B1）基因或称STK11（Serine-Threonine kinase11）基因，定位于人染色体19p13.3位置，含10个外显子，编码的LKB1蛋白由433个氨基酸组成，分子量约为50kDa，包括激酶区域（44-309）、N端调节域和C端调节域。N端调节域含一个核定位序列，使LKB1蛋白定位于细胞核内。LKB1基因编码一种丝-苏氨酸蛋白激酶，参与多种生物学过程，包括细胞周期阻滞、p53介导的凋亡、细胞极性诱导等，介导TGF-β、G蛋白偶联等信号通路，在细胞生长、分化调控中发挥着重要作用，在人体多种组织中均有表达，以上皮、睾丸生精小管、肝脏、小肠和骨骼肌最多。LKB1基因是肿瘤易患综合症，即PJ综合征（Peutz-Jeghers syndrome，PJS）的致病基因，在高达90%的PJS病人中可检测到LKB1基因的胚系突变。LKB1基因的功能异常还与全身多种散发性肿瘤的发生密切相关，如在30-40%的非小细胞肺癌、20%的宫颈癌、19%鳞状细胞癌及13%乳腺侵润性导管癌中均有LKB1基因的失活。另外，LKB1基因在恶性肿瘤发生中起着重要作用，研究证实LKB1能够使细胞周期停滞在G1期，抑制细胞生长。LKB1基因是一个较为普遍的抑癌基因。LKB1基因表达情况为肿瘤发生和预后影响的一个重要中间指标，对揭示LKB1基因抑制细胞恶性增殖的分子背景有重要的意义，因此，LKB1基因表达情况的检测，即LKB1蛋白水平检测或LKB1mRNA的水平检测是亟待解决的问题。

目前，现有技术中LKB1基因表达情况的检测主要为LKB1蛋白的检测，一种现有技术利用兔源多克隆抗体作为一抗，然后用标记了化学显色试剂或者荧光基团的二抗对一抗进行标记，一抗与LKB1蛋白结合后再用化学显色试剂的颜色或者荧光基团的荧光信号来判断LKB1蛋白的丰度。这种间接的检测方法步骤繁琐耗时长，并且由于多克隆抗体的特异性不强导致非特异性信号的产生，对检测结果的准确性有很大影响。还有一种现有技术是利用DAB显色的原理，对LKB1鼠源单克隆抗体进行显色标记，然后LKB1抗原免疫组化染色，再用光学显微镜观察，出现棕黄色或棕褐色的为阳性，综合考虑阳性细胞着色深浅和阳性细胞占所观察同类细胞的比例两项指标，进行半定量判断结果。这种方法中使用的DAB染色剂有毒性，为疑似致癌物质，不安全，另外，显色剂显色反应受温度影响大，且显色时间受到限制，不能长期保存，实验人员无法将组织切片保存进行重复观察。LKB1mRNA水平检测方法还未见报道。

量子点具有宽的激发光谱和窄的发射光谱（光谱宽在20-40nm之间），通过改变量子点的尺寸或者改变量子点内核的组分可以在很大范围内调节量子点的发射光谱。量子点与有机荧光团相比有几个突出的光学特点：窄的发射光谱能减少光谱重叠，能同时区别多个荧光团；宽的激发光谱能在单一波长下激发多种颜色的光谱。此外量子点具有光稳定性和抗降解性，对细胞的毒性小。这些独特的性质使量子点能在体内跟踪多个细胞和制备体外多个分子生物传感器，由于量子点具有可调谐的发光波长，量子点能促进组织深层的细胞成像。

发明内容

本发明旨在解决上述现有技术中存在的问题，提出一种LKB1mRNA检测方法，包括以下步骤：

制备LKB1mRNA原位杂交探针；

用量子点标记LKB1mRNA原位杂交探针，得到量子点LKB1mRNA原位杂交探针；

用量子点LKB1 mRNA原位杂交探针与标本进行原位杂交；

将杂交后的标本置于显微镜下观察，

其中，所述的LKB1mrNA原位杂交探针为一段与LKB1mRNA特异性结合的单链DNA或单链RNA；所述的标本为细胞标本或组织标本，所述的细胞标本为组织印片、细胞爬片或细胞涂片，所述的组织标本为石蜡切片或冰冻切片。

优选地，所述的用量子点标记LKB1mRNA原位杂交探针包括以下步骤：

将量子点表面用COOH和OH进行修饰，得到OH/COOH-量子点；

将LKB1mRNA原位杂交探针用氨基修饰，得到氨基-LKB1mRNA原位杂交探针；

OH/COOH-量子点与氨基-LKB1mRNA原位杂交探针反应，得到量子点LKB1mRNA原位杂交探针。

优选地，所述的将量子点表面用COOH和OH进行修饰的步骤为：

在DHLA与巯基乙醇的混合液中加入量子点进行反应，得到第一反应液；