[发明专利]一种耐热β-1，4-内切木聚糖酶(SyXyn11)基因的异源表达

说明书

技术领域

本发明涉及一种来源于细菌的耐热β-1，4-内切木聚糖酶(SyXyn11)基因的异源表达、活性测定及分析和酶学性质分析方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

β-1，4-内切木聚糖酶(endo-β-1，4-xylanase，EC 3.2.1.8)，能从木聚糖主链的内部随机切割木糖苷键，将其降解成寡聚木糖、木二糖和少量木糖。根据催化结构域氨基酸的同源性和疏水簇分析法可将木聚糖酶划分为糖苷水解酶10家族和11家族。木聚糖酶在造纸、食品、饲料、纺织等工业领域都有着重要的应用价值，但由于纸浆漂白、饲料制粒等工艺均需要较高温度，因此耐热木聚糖酶的研究和开发得到了很多研究者的青睐。目前已发现了许多能产11家族耐热木聚糖酶的微生物，其中许多耐热木聚糖酶基因已被克隆并表达在合适的宿主中。毕赤酵母表达系统由于能高效分泌外源蛋白到胞外，并能进行高密度发酵，因而在木聚糖酶研究中备受关注。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于细菌的耐热β-1，4-内切木聚糖酶(SyXyn11)基因的异源表达、活性测定及分析和酶学性质分析方法，为该基因的异源高效表达和产业化生产奠定理论基础。EvXyn11^TS是一种来源于细菌的极端耐热木聚糖酶突变体(GenBank登录号EU591743)，它的热稳定性非常好，具有适合于工业应用的理想特性。为实现EvXyn11^TS在工业上的应用，拟将该耐热基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的进行分泌表达，但是由于它来源于细菌，其密码子偏好性与毕赤酵母有较大差异，于是对此耐热基因中的稀有密码子进行优化，并命名为Syxyn11。

本发明的技术方案：一种源自细菌的耐热β-1，4-内切木聚糖酶(SyXyn11)，其基因(Syxyn11)完整的mRNA核苷酸序列为SEQ IDNO：1。

所述的由完整mRNA推导的SyXyn11氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

所述的Syxyn11完整的异源表达、活性测定及分析和酶学性质分析方法：

(1)重组质粒pUCm-T-Syxyn11的构建：根据密码子的偏爱性，宿主细胞能够以不同的速度合成蛋白质。编码蛋白质的基因中有些密码子对应的tRNA含量少(即属于稀有密码子)，所以合成量较少，宿主以此来控制蛋白质的合成速度。因此按照密码子的偏好性，对外源蛋白编码基因进行密码子优化可以有效提高外源蛋白的表达量。为实现来源于细菌的耐热木聚糖酶基因Evxyn11^TS在P.pastoris中的高表达，对Evxyn11^TS成熟肽基因序列(585bp)进行分析，发现其密码子的偏好性与毕赤酵母有很大差异。遂对照毕赤酵母密码子偏好性表对Evxyn11^TS中的稀有密码子进行优化，并在基因两端分别加入EcoR I、Not I位点，该基因命名为Syxyn11，人工合成后克隆至pUCm-T质粒，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，获得重组质粒pUCm-T-Syxyn11。

(2)重组表达质粒的构建：将上述得到的重组质粒pUCm-T-Syxyn11进行EcoR I和Not I双酶切，割胶回收产物与经同样双酶切的质粒pPIC9K连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，经PCR筛选鉴定后，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，获得重组质粒pPIC9K-Syxyn11。

(3)Syxyn11在P.pastoris中的表达：pPIC9K-Syxyn11经Sal I线性化后，用电穿孔法将其导入P.pastoris GS115中，涂布于MD平板上进行初步筛选，最终在YPD平板上筛选出抗高浓度G418的重组毕赤酵母，命名为GS115/Syxyn11；同时电转pPIC9K至P.pastoris GS115做对照，并命名为GS115/9K。提取重组子的基因组DNA，以此为模板，进行PCR验证。

(4)木聚糖酶的活性测定及分析：木聚糖酶酶活测定采用改良的DNS试剂法。蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝染色法(Bradford法)，并采用SDS-PAGE对表达产物进行分析及表观分子量的测定。