[发明专利]一种耐热β-1，4-内切木聚糖酶(SyXyn11)基因的异源表达

权利要求书

1.一种源自细菌的耐热β-1，4-内切木聚糖酶(SyXyn11)的优化基因，其完整mRNA的核苷酸序列对应于序列表中的SEQ ID NO：1。

2.这种源自细菌的耐热β-1，4-内切木聚糖酶(SyXyn11)，基因优化后其氨基酸序列对应于序列表中的SEQ ID NO：2。

3.所述的Syxyn11完整的异源表达、活性测定及分析和酶学性质分析方法：

(1)重组质粒pUCm-T-Syxyn11的构建：根据密码子的偏爱性，宿主细胞能够以不同的速度合成蛋白质；编码蛋白质的基因中有些密码子对应的tRNA含量少(即属于稀有密码子)，所以合成量较少，宿主以此来控制蛋白质的合成速度；因此按照密码子的偏好性，对外源蛋白编码基因进行密码子优化可以有效提高外源蛋白的表达量；为实现来源于细菌的耐热木聚糖酶基因Evxyn11^TS在P.pastoris中的高表达，对Evxyn11^TS成熟肽基因序列(585bp)进行分析，发现其密码子的偏好性与毕赤酵母有很大差异；遂对照毕赤酵母密码子偏好性表对Evxyn11^TS中的稀有密码子进行优化，并在基因两端分别加入EcoR I、Not I位点，该基因命名为Syxyn11，人工合成后克隆至pUCm-T质粒，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，获得重组质粒pUCm-T-Syxyn11；

(2)重组表达质粒的构建：将上述得到的重组质粒pUCm-T-Syxyn11进行EcoR I和NotI双酶切，割胶回收约600bp的目的基因Syxyn11，与经同样双酶切的质粒pPIC9K连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，经通用引物(5′-AOX和3′-AOX)PCR筛选鉴定后，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，获得重组质粒pPIC9K-Syxyn11；

(3)Syxyn11在P.pastoris中的表达：pPIC9K-Syxyn11经Sal I线性化后，用电穿孔法将其导入P.pastoris GS115中，涂布于MD平板上筛选重组毕赤酵母；在MD平板上将生长良好的菌落用牙签点种至含不同浓度G418的YPD平板上筛选抗高浓度G418(2.0mg/mL)的重组毕赤酵母，命名为GS115/Syxyn11；同时电转pPIC9K至P.pastoris GS115做对照，并命名为GS115/9K；参照《分子克隆实验指南》中的方法提取重组子的基因组DNA；以此为模板，利用通用引物5′-AOX和3′-AOX进行PCR验证；耐热木聚糖酶基因Syxyn11的常规诱导表达参见Multi-Copy Pichia Expression Kit(Invitrogen公司)操作手册；

(4)木聚糖酶的活性测定及分析：木聚糖酶酶活测定采用改良的DNS试剂法，用榉木木聚糖作为底物，其中酶反应温度设定为65℃，以在测定的条件下，每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量定义为1个酶活单位(U)；蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝染色法(Bradford法)，以牛血清白蛋白为标准；并采用SDS-PAGE对表达产物进行分析及表观分子量的测定；

(5)重组木聚糖酶酶学性质分析：酶的最适反应温度及热稳定性：取适当稀释酶液于55～95℃水浴条件下进行酶解反应，每隔5℃，分别测定酶活，以酶活力最高者为100％，作温度-相对酶活性曲线；将酶液于不同温度下保温不同时间后，按常规方法测定残余酶活性，以0min时取出的酶液的酶活性为100％，作温度-相对酶活性曲线。当残余酶活达到85％以上，即定义为稳定；

酶的最适pH及pH稳定性：65℃下，分别测定木聚糖酶在不同pH值下的酶活性；以酶活力最高者为100％，作pH-相对酶活性曲线；将酶在不同的pH值条件下于40℃保温1h，再分别测定残留酶活性，以酶活力最高者为100％，作pH-相对酶活性曲线；当残余酶活达到85％以上，即定义为稳定；反应所用的缓冲液为：0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH3.5～8.0)和0.05mol/L甘氨酸-氢氧化纳缓冲液(pH 8.5～9.5)；

金属离子对酶活性的影响：将不同金属离子溶液与酶液混合，至终浓度为2mmol/L，40℃保温1h，然后按常规方法测定残余酶活性，以不加金属离子的酶活性定义为100％，残余酶活与其的比值为相对酶活。