[发明专利]一种小麦胚芽脂肪酶的固定化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种小麦胚芽脂肪酶的固定化方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

    脂肪酶（EC 3.1.1.3）是一种重要的水解酶类，在食品、药品、化工等行业得到广泛应用。脂肪酶种类很多，其中绝大多数来自于微生物，少数来自于动物，而极少数来自于植物。小麦胚芽脂肪酶是一种存在于小麦中的脂肪酶，由于其热稳定性以及在小麦发芽中的重要性，为大家所关注。一般认为小麦胚芽当中富含多种酶类，有α-淀粉酶、脂肪酶、酯酶、脂肪氧化酶和蛋白酶等，其中主要是脂肪酶以及酯酶；尤其是在发芽后所显示的酶活主要是脂肪酶酶活。

小麦胚芽脂肪酶的存在对小麦胚芽的保藏是十分不利的，它能短时间内水解油脂，使其脂肪酸值大幅度升高，引起麦胚酸败变质；同时，微生物生长繁殖快，也会导致麦胚出现结块、霉变和发酵等变质现象。所以，目前对小麦胚芽脂肪酶的研究大多集中在该酶在小麦胚芽中的稳定性以及如何快速降低其水解活性，防止麦胚酸化变质。对小麦胚芽脂肪酶用于催化生物反应过程研究相对较少，主要集中在手性拆分和油脂工业方面。据报道，小麦胚芽脂肪酶在立体选择性方面并不符合Kazlauskas规则，呈现为反K氏规则，是现有唯一天然来源的反K氏规则的脂肪酶，这在手性拆分和脂肪酶催化分子机理解析方面具有重要的意义。在油脂催化方面，目前认为，小麦胚芽脂肪酶只对短链的甘油三酯具有催化作用，而对长链甘油三酯几乎没有作用。总体而言，相对于其它脂肪酶，小麦胚芽脂肪酶稳定性和活性都较低。通过某种手段改善小麦胚芽脂肪酶的不稳定性和低活性，是拓宽其应用范围的一大研究方向。

固定化酶技术是通过物理或化学的方法，将酶束缚在载体上，使其既保持酶的天然活性，又便于与反应液分离，可以重复使用。固定化酶与游离酶相比，主要有下列优点：(l)产物不易被酶污染，简化后续的分离提纯工艺；(2)在大多数情况下，酶在固定化后稳定性会得到提高并可重复使用，从而便于连续化生产，降低生产成本；(3)固定化酶具有一定的机械强度，可以采用搅拌或装柱的方式使用，便于生产过程实现管道化、连续化和自动化。酶固定化技术的显著优势使得该领域的研究一直受到广泛关注，工业化应用的例子也越来越多。

因此，通过酶固定化方法提高小麦胚芽脂肪酶的稳定性和重复利用次数是降低使用成本和简化分离纯化工序的一种有效手段。小麦胚芽脂肪酶经固定化之后载体对其具有保护和缓冲作用，在催化反应过程中大大降低了反应环境对其影响，如在有机溶剂反应中，可减轻有机溶剂对其的失活作用。此外，在固定化的过程中，可对酶分子进行一定的化学修饰作用，使脂肪酶分子α螺旋“盖子”处于开启状态，有助于底物分子进入袋型结构与酶分子催化三联体结合，提高酶与底物之间的传质作用，加快反应的进行。

发明内容

    本发明的目的是为了克服游离小麦胚芽脂肪酶稳定性和重复利用性差的缺点，提出一种化学法固定小麦胚芽脂肪酶的方法。该方法采用价格低廉的载体，经过简单的几步反应就达到了固定化目的。在固定化过程中，反应条件温和、所用试剂毒性均较低，对人体和环境危害小。酶经固定化之后结合牢固，不易从载体脱落，大大提高了重复利用次数。

    本发明的技术方案：为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种小麦胚芽脂肪酶的固定化方法，包括以下步骤：

（1）用环氧氯丙烷活化载体，使载体带上环氧基；

（2）用一种带氨基的化合物将步骤（1）已活化载体上的环氧基团打开，使载体带上连接基团氨基；

（3）步骤（2）获得的载体通过连接物与小麦胚芽脂肪酶共价连接。

本发明中在步骤（1）环氧氯丙烷活化过程中引入一定体积的水溶性助溶剂，一方面有助于解决环氧氯丙烷在水中的溶解度有限，造成其在载体中扩散通量较低，活化反应时间延长的问题；另一方面，可抑制环氧基在碱性条件下发生水解反应，提高修饰密度。水溶性助溶剂的种类可以是二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、二氧六环、乙腈、丙酮、正己烷中的一种或一种以上的混合物，其中二甲亚砜效果最佳。助溶剂加入量占总体系体积的5%-40%，较佳地选择10%-20%。

环氧化时间对最终环氧基密度影响很大。反应时间过短，载体上羟基未能全部被取代；反应时间过长，容易使载体环氧化之后，环氧基发生水解反应，降低环氧基密度。因此，在环氧化反应过程中，要严格控制好时间1-8h。较优地，将时间控制在2-4h。

环氧氯丙烷活化载体的温度为30-50℃，较优的，将温度控制在40℃。