[发明专利]豇豆白蛋白亚组分1b及其制备与在绿色杀虫剂中应用

说明书

技术领域

本发明属于植物生物工程和无公害生物杀虫剂的技术领域，特别涉及一种豇豆白蛋白亚组分1b及其制备与在绿色杀虫剂中应用。

背景技术

储粮害虫的危害是世界上粮食储藏中的一个重要问题，它们能够严重降低储粮的产量和质量。我国每年粮食收获后由于储粮害虫造成约3%～5%的损失。据国家粮食局相关统计数字表明：2004年中国的粮食总产量约为4.5亿吨，农户储粮约为2.7亿吨，若能将储粮损失由10%减少到4%左右，就等于增产了1620万吨粮食，这相当于我国产粮大省山东一年的小麦产量。因此，储粮害虫的防治工作应引起大家的高度重视。这在当前我国人口不断增加，耕地面积不断减少，粮食产量逐年下降，粮食缺口日益增大的形势下，减少已经收获粮食的损失，开发“无形粮田”，有着特别重要的意义。

目前，我国在国家粮库和地方粮库中主要采用熏蒸剂和化学防护剂防治储粮害虫，由此产生的3R问题即残留（Residue）、抗性（Resistance）及害虫再猖獗（Resurgence）也日趋明显。因此，寻找更有效、安全的方法来控制储粮害虫的危害，一直都是我们所面临的紧迫课题。

利用植物次生代谢产物开发与环境和谐的杀虫剂是当今生物农药的研究热点。植物次生代谢产物是植物长期与昆虫协同进化过程中抵御昆虫植食行为而产生的化学物质，这些活性物质可以经过加工成为植物性杀虫剂，对害虫具有多种生物活性、对天敌影响小、在环境中容易降解、昆虫不易产生抗药性等特点，符合新世纪对农药的要求。随着我国可持续植保发展战略的实施，对农药的安全使用要求也日益严格，尤其对储粮害虫中应用的杀虫剂，要求既能防治害虫的发生，又不对储粮和环境产生污染，且不对人的健康造成威胁。因此，植物源高效低毒杀虫剂的研究与应用是储粮害虫防治工作中一个非常重要的研究课题。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种豇豆白蛋白亚组分1b。

本发明的另一目的在于提供所述的豇豆白蛋白亚组分1b的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述的豇豆白蛋白亚组分1b的应用，可用于制备绿色杀虫剂。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种豇豆白蛋白亚组分1b，氨基酸序列如下所示：Ala Ser Cys Asn Gly Val Cys Ser Pro Phe Glu Met Pro Pro Cys GlyThr Ser Val Cys Arg Cys Ile Pro Val Gly Leu Val Ile Gly Tyr Cys Arg Asn Pro SerGly；缩写形式如下：ASCNGVCSPFEMPPCGTSVCRCIPVGLVIGYCRNPSG；

编码所述的豇豆白蛋白亚组分1b的核苷酸序列如下所示：GCTTCTTGCAACGGTGTTTGCTCTCCGTTCGAAATGCCGCCGTGCGGTACCTCTGTTTGCCGTTGCATCCCGGTTGGTCTGGTTATCGGTTACTGCCGTAACCCGTCTGGT；

所述的豇豆白蛋白亚组分1b优选通过DNA体外重组的方法，构建出表达豇豆白蛋白亚组分1b的基因工程菌，通过液体深层发酵培养的方式进行豇豆白蛋白亚组分1b的批量生产，具体包含以下步骤：

（1）重组蛋白生产的基因工程菌株构建：

以豇豆cDNA文库为模板，以上游引物Xho Ⅰ-PA-F和下游引物NotⅠ-PA-R为引物对，进行PCR扩增获得目的基因片段，目的基因片段与毕赤酵母表达载体pPICZα经内切酶Xho Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后连接，构建表达产物的重组质粒pPICZα-1b；重组质粒pPICZα-1b经Sal Ⅰ处理成线状后，采用电转化的方法将其导入毕赤酵母细胞GS115，在含Zeocin选择压力的YPD培养基中，筛选具有目的蛋白表达能力的基因工程转化菌株；

上游引物XhoⅠ-PA-F：5′-CTC TCG AGA AAA GAG AGG CTG CTT CTTGCA ACG GTG TTT G-3′；

下游引物NotⅠ-PA-R：5′-GAT CTC AGT GGT GGT GGT GG-3′；

（2）豇豆白蛋白亚组分1b重组蛋白的发酵生产：

①富集菌体：将步骤（1）得到的基因工程转化菌株接种到MGYH液体培养基中，在25～30℃下培养至OD600为2.6，得到发酵液；将发酵液离心，收集细胞；