[发明专利]豇豆白蛋白亚组分1b及其制备与在绿色杀虫剂中应用

权利要求书

1.一种豇豆白蛋白亚组分1b，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的豇豆白蛋白亚组分1b的核苷酸序列SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的豇豆白蛋白亚组分的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）重组蛋白生产的基因工程菌株构建：

以豇豆cDNA文库为模板，以上游引物Xho Ⅰ-PA-F和下游引物NotⅠ-PA-R为引物对，进行PCR扩增获得目的基因片段，目的基因片段与毕赤酵母表达载体pPICZα经内切酶Xho Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后连接，构建表达产物的重组质粒pPICZα-1b；重组质粒pPICZα-1b经Sal Ⅰ处理成线状后，采用电转化的方法将其导入毕赤酵母细胞GS115，在含Zeocin选择压力的YPD培养基中，筛选具有目的蛋白表达能力的基因工程转化菌株；

上游引物Xho Ⅰ-PA-F：5′-CTC TCG AGA AAA GAG AGG CTG CTT CTTGCA ACG GTG TTT G-3′；

下游引物Not Ⅰ-PA-R：5′-GAT CTC AGT GGT GGT GGT GG-3′；

（2）豇豆白蛋白亚组分1b重组蛋白的发酵生产：

①富集菌体：将步骤（1）得到的基因工程转化菌株接种到MGYH液体培养基中，在25～30℃下培养至OD600为2.6，得到发酵液；将发酵液离心，收集细胞；

②诱导重组蛋白表达：用BMMH液体培养基悬浮步骤①得到的细胞至OD600为0.1，继续培养，诱导抗虫蛋白表达，每24h添加甲醇，保持甲醇在培养体系中的终浓度为体积百分比0.5%，维持诱导压力，促使重组蛋白表达；

（3）豇豆白蛋白亚组分1b重组蛋白的分离纯化：将步骤（2）经甲醇诱导重组蛋白表达的发酵液离心除去细胞后，上清液采用截留分子量10K的超滤膜分离，滤液采用HPLC分离，HPLC分离条件如下：色谱分离柱为5μNucleosil-300C18，洗脱液为含体积百分比0.1%三氟乙酸的乙腈溶液，其中乙腈溶液为线性梯度，乙腈起始浓度为体积百分比20%，终浓度为体积百分比99.9%，总洗脱时间为60min，流速1ml/min，收集滞留时间为28～30min的分部组分，真空干燥，得到豇豆白蛋白亚组分1b重组蛋白；

步骤（2）中所述的MGYH液体培养基的组成如下：质量体积比1.34%的YNB，质量体积比1%的甘油，450μg/L生物素，质量体积比0.004%的组氨酸；

步骤（2）中所述的BMMH液体培养基的组成如下：100mmol/L磷酸钠，pH6.0，质量体积比1.34%的YNB，450μg/L抗生素博莱霉素，体积百分比0.5%的甲醇和质量体积比0.004%的组氨酸。

4.根据权利要求3所述的豇豆白蛋白亚组分的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的PCR的条件如下：94℃5min；94℃60s、55℃50s、72℃50s，35个循环；72℃10min。

5.根据权利要求3所述的豇豆白蛋白亚组分的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的毕赤酵母表达载体pPICZα为pPICZα-A、pPICZα-B或pPICZα-C。

6.权利要求1所述的豇豆白蛋白亚组分1b在制备绿色杀虫剂中的应用。

7.一种豆科植物源性储粮害虫无公害绿色杀虫剂，其特征在于，含有权利要求1所述的豇豆白蛋白亚组分1b，所述的豇豆白蛋白亚组分1b在所述的豆科植物源性储粮害虫无公害绿色杀虫剂的含量为质量百分比0.02～0.10%。

8.根据权利要求7所述的豆科植物源性储粮害虫无公害绿色杀虫剂，其特征在于包含以下按质量百分比计的成分：所述的豇豆白蛋白亚组分1b  0.02～0.10%、木质素磺酸盐5.0～15.0%、拉开粉10.0～25.0%、苯甲酸钠1.0～2.0%、淀粉50.0～85.0%。

9.根据权利要求7所述的豆科植物源性储粮害虫无公害绿色杀虫剂，其特征在于：所述的淀粉为小麦面粉。

10.权利要求7所述的豆科植物源性储粮害虫无公害绿色杀虫剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）将豇豆白蛋白亚组分1b溶解于0.05mol/L、pH6.0的磷酸盐缓冲液中，然后加入淀粉混匀，制成颗粒，室温放置过夜干燥；

（2）在步骤（1）干燥后的颗粒中加入木质素磺酸盐、拉开粉和苯甲酸钠，混匀后，粉碎，得到豆科植物源性储粮害虫无公害绿色杀虫剂；

其中，各成分的质量百分含量如下：豇豆白蛋白亚组分1b 0.02～0.10%、木质素磺酸盐5.0～15.0%、拉开粉10.0～25.0%、苯甲酸钠1.0～2.0%、淀粉50.0～85.0%。