[发明专利]一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于拟穴青蟹遗传标记检测领域，特别是涉及一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法。

背景技术

单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs）分子标记几乎存在于所有真核生物基因组中，是生物基因组中最丰富的遗传变异资源。SNPs具有典型的二等位基因性，大多数生物基因组平均每200bp~1000bp核苷酸中就会存在一个SNP。由于SNPs具有众多优点，因此被认为是遗传学和进化学研究领域最具有潜力的一种遗传标记。目前，已经在多种水产养殖动物中报道了SNPs分子标记，如：凡纳滨对虾、日本牙鲆、虹鳟、大西洋鲑、牡蛎等。

拟穴青蟹（Scylla paramamosain）属节肢动物门（Arthropoda）、甲壳纲（Crustacea）、十足目（Decapoda）、梭子蟹科（Portunidae）、青蟹属（Scylla），在我国主要分布于长江口及以南沿海海域，是我国重要的海洋渔业资源和海水养殖蟹类。拟穴青蟹具有体型大、生长速度快、肉味鲜美等优点，深受广大消费者青睐。近年来，我国拟穴青蟹的人工养殖年产量一直稳定在10万吨以上，保持了健康的发展势头。学者们围绕拟穴青蟹繁殖生物学、养殖生物学等方面已经开展了较多的研究工作，但对遗传学及育种学方面的研究还较少。目前，在拟穴青蟹中已经开展了线粒体DNA和微卫星分子标记的研究，而对SNPs标记的研究还甚少，限制了群体遗传多样性评估、遗传图谱构建及分子标记辅助育种等研究的开展。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，该方法具有实验周期短、成本低、操作简单等优点，能够准确地检测出不同个体的基因型，从而为拟穴青蟹分子遗传学及分子辅助育种研究提供新型遗传标记。本发明提供的20个SNPs分子标记可应用于拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源评估与保护及遗传连锁图谱构建等领域。

本发明的一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，包括：

（1）拟穴青蟹基因组DNA序列的获取

基因组序列可以通过两种渠道获得：第一，利用已经构建的拟穴青蟹基因组文库或转录组文库中的序列；第二，利用GeneBank数据库中的公开的拟穴青蟹功能基因序列。

（2）DNA序列测序与候选SNPs鉴定

首先，对所获得的基因组序列分段设计引物，PCR扩增产物大小在500bp~900bp之间为宜；其次，采用上述引物对5~30个无亲缘关系的拟穴青蟹个体进行PCR扩增；然后，选取扩增清晰、产量高、无非特异扩增的PCR产物送测序公司进行双向、直接测序；最后，对测序结果进行分析，比较不同个体在同一碱基位点的序列差异，鉴定出候选SNPs位点。

（3）SNPs验证与基因分型

首先，针对每一个候选SNPs位点设计3条引物，包括2条等位基因特异的上游引物（F1和F2）和1条通用的下游引物（R）。2条上游引物分别以SNP位点的2个不同的碱基作为引物的3’末端，并且在5’端分别加上长度不同的人工序列(GCGGGCAGGGCGGC和GCGGGC)；然后，以拟穴青蟹1个野生群体共30只个体的基因组DNA为模板，采用上述引物进行实时荧光定量PCR扩增，分析其溶解曲线的差异，若出现2条溶解曲线，表明该SNP位点是杂合型的；若出现1条溶解曲线，表明该SNP位点是纯合型的。由此，可获得不同SNPs位点在所有个体的基因型。

所述步骤（2）中的引物共设计11对，其序列和退火温度如下：

第一对引物：F：CAATGGCTGACGCTGCTAC

R：GCGCTTGTTGGAGATATCG

退火温度：58℃

第二对引物：F：GTGAGCACTGGGCTGTATG

R：GGTATGTGTTCTTTATTATTTCGT

退火温度：58℃

第三对引物：F：ACACGAAGTAACGAGCCG

R：GATGACCAAAGCAGCAAAA

退火温度：57℃

第四对引物：F：CCTGTTGACTGGGAGTGTC

R：AATGATGCAAGCCTAGTATGA