[发明专利]一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法

权利要求书

1.一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，包括：

（1）拟穴青蟹基因组DNA序列的获取；

（2）对所获得的DNA序列设计引物，并在拟穴青蟹多个个体中进行PCR扩增，对扩增产物进行序列测定，再比较分析不同个体间序列差异，鉴定出候选SNPs位点；

（3）针对候选SNPs位点设计等位基因特异引物，采用荧光实时定量PCR仪进行基因分型，并分析SNPs的基因型。

2.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，其特征在于：所述步骤（1）中的拟穴青蟹基因组DNA序列来源于测序获得的基因组文库或转录组文库序列或GenBank数据库中公开的拟穴青蟹基因组序列。

3.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，其特征在于：所述步骤（2）中的引物共设计11对，其序列和退火温度如下：

第一对引物：F：CAATGGCTGACGCTGCTAC

R：GCGCTTGTTGGAGATATCG

退火温度：58℃；

第二对引物：F：GTGAGCACTGGGCTGTATG

R：GGTATGTGTTCTTTATTATTTCGT

退火温度：58℃；

第三对引物：F：ACACGAAGTAACGAGCCG

R：GATGACCAAAGCAGCAAAA

退火温度：57℃；

第四对引物：F：CCTGTTGACTGGGAGTGTC

R：AATGATGCAAGCCTAGTATGA

退火温度：56℃；

第五对引物：F：CAACATGTGTGACGACGAAGT

R：AGGATGGCGTAGGGAAGG

退火温度：60℃；

第六对引物：F：GCAGCATCATCTATATTTGTTC

R：GCTTGTAATGTTTAGTTGGTCA

退火温度：59℃；

第七对引物：F：GATGAAGGTCACGAGCAGA

R：TGATGGCTGAAGCACAATAC

退火温度：58℃；

第八对引物：F：TTTAGCACCATTAGGACTG

R：GAGGATGACCTGGAGAAG

退火温度：56℃；

第九对引物：F：TAACGCACTAACAATTCTGCT

R：CAACCACATTCACTCATGGA

退火温度：56℃；

第十对引物：F：GAACAAGAGTTTGGCCTAGT

R：TCAATATCATCAGAGTTATTTTATT

退火温度：52℃；

第十一对引物：F：CACCTACCTTCTTCCTTCCAGT

R：CGGGGGTTGTCAAGAGTGT

退火温度：60℃。

4.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，其特征在于：所述步骤（2）中的PCR扩增需在5~30个不存在亲缘关系的个体中进行。

5.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，其特征在于：所述步骤（2）中的测序方法为PCR产物双向直接测序。

6.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，其特征在于：所述步骤（2）中的候选SNPs的鉴定方法是：通过比较分析不同个体测序峰图，寻找不同个体在相同DNA碱基位置上的单碱基突变位点，即为候选SNPs。

7.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，其特征在于：所述步骤（3）中的等位基因特异引物的设计方法为：每个位点设计3条引物，包括2条长度不一的上游引物F1和F2，且在其5’端分别连接长度不一的人工序列GCGGGCAGGGCGGC和GCGGGC；1条下游通用引物R。

8.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹SNPs分子标记的筛选方法，其特征在于：所述步骤（3）中的SNPs位点及其等位基因特异引物序列特征如下：

ScPaSNP28：F1：GCGGGCAGGGCGGCACTGGCCCACTGGTCGC

F2：GCGGGCACTGGCCCACTGGCGGT

R：ACACCAGGAAGGTCTTGTTGTCGTT；

ScPaSNP34：F1：GCGGGCAGGGCGGCCAGGTAGTGGCTGGTGAAGACATC

F2：GCGGGCCAGGTAGTGGCTGGTGAAGACATT

R：TTGGATAGGATCACCGTCTGCTCGT；

ScPaSNP35：F1：GCGGGCAGGGCGGCAGGTCACGAGCAGACGGAGAC

F2：GCGGGCAGGTCACGAGCAGACGGAGAT

R：TGGTAAATGAATTGTAATCCTCGTGCT；

ScPaSNP36：F1：GCGGGCAGGGCGGCGTGAGTGCGTCGTGTCTGGC

F2：GCGGGCGTGAGTGCGTCGTGTGAGGA

R：ATGCAGATTGTATGGACTTTGACCTCC；

ScPaSNP39：F1：GCGGGCAGGGCGGCCGGTTCTATTTAATGCGTGCG

F2：GCGGGCCGGTTCTATTTAATGCGTGCA

R：CACAGTACAAAGACGTGGCCTCGAA；

ScPaSNP40：F1：GCGGGCAGGGCGGCGCCATAAGCAGCAGATAACC

F2：GCGGGCAGCCATAAGCAGCAGATAATA

R：CTTTGGTAGTCAGGTACTGCCTAAGTCA；

ScPaSNP41：F1：GCGGGCAGGGCGGCTCACCAGTGTGTGATGGCG

F2：GCGGGCGTCACCAGGGTGTGATGGAC

R：CCGACGTAGGCATCCTTCTGAC；

ScPaSNP43：F1：GCGGGCAGGGCGGCCGTCCTGCTCACTGAGGGC

F2：GCGGGCCCGTCCTGCTCACTGAGGAT

R：AGGTTTCAAACATGATCTGGGTCAT；

ScPaSNP44：F1：GCGGGCAGGGCGGCGAAACCATCAAGATCTCCTGAGC

F2：GCGGGCAGAAACCATCATAATCTCCTGACT

R：GTGCACTTTTATTTAATGTGGCCTG；

ScPaSNP45：F1：GCGGGCAGGGCGGCGGCCACATTAAATAGAAGTGCATC

F2：GCGGGCGGCCACATTAAATAAGAGTGCAGT

R：GGGCCTTGCAGGAATGTTTGTC；

ScPaSNP48：F1：GCGGGCAGGGCGGCACTCTATCCGCCTTCAGTCGG

F2：GCGGGCTTAACTCTATCCCGCTTCAGTCTA

R：CCTGACACGACGCACTCACCTA；

ScPaSNP49：F1：GCGGGCAGGGCGGCCCTTCAGTCCGAGAAAGATTGC

F2：GCGGGCCCCTTCAGTCCGAGAAAGATTAT

R：CTGTGGTTGTGCCCCAGCCTG；

ScPaSNP50：F1：GCGGGCAGGGCGGCCGAGAAAGATTTCTTAGGTGCG

F2：GCGGGCCGAGAAAGATTTCTTAGGTGGC

R：CTGTGGTTGTGCCCCAGCCTG；

ScPaSNP51：F1：GCGGGCAGGGCGGCGACTGCCTGAAGGAGGAACG

F2：GCGGGCGGACTGCCTGAAGGAGGAATA

R：CCATTACATGCCAAAGGTCCACC；

ScPaSNP53：F1：GCGGGCAGGGCGGCATCCGTGGGAGATTCTCGC

F2：GCGGGCTTCATCCGTGGGAGATTCTCTT

R：GGTTGCCGGTCCAGCTAAACAT；

ScPaSNP56：F1：GCGGGCAGGGCGGCCGGAGGAAGGGCGAGC

F2：GCGGGCGCGGAGGAAGGGCGAGT

R：CTCGCCGGACGTAAGTCAAATC；

ScPaSNP59：F1：GCGGGCAGGGCGGCTAAGGAAGGAAGACTGCCGGT

F2：GCGGGCCTAAGGAAGGAAGACTGCACGA

R：TGCACTCTCTCGTCCCCGTCAC；

ScPaSNP61：F1：GCGGGCAGGGCGGCATGTGATAATAAGGCTAATTGCTGC

F2：GCGGGCCATGTGATAATAAGGCTAATTGCTCT

R：TGTATATAATGCAGTAATAGAAGAACGACA；

ScPaSNP63：F1：GCGGGCAGGGCGGCCCTTTCTTGGCAACGTCGC

F2：GCGGGCTCCTTTCTTGGCAACGTCCT

R：GTGAATAATGGCACGGTTTACCTCG；

ScPaSNP64：F1：GCGGGCAGGGCGGCACGTCACGGGCAGCCTAG

F2：GCGGGCCGTCACGGGCAGCCTTC

R：CATGCAGTGAATAATGGCACGGTT。