[发明专利]一种简化的可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法

权利要求书

1.一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法，其特征在于包括以下步骤：每年放流季节，海捕野生交尾雌虾，并眼柄标记，然后进行苗种培育，生产完成的雌虾-75℃超低温冰箱保存备用；秋季，在各放流洄游点进行放流个体的捕捞取样，样品回捕后通过两组中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术检测放流个体及数量，最终确定中国对虾的放流效果；

所述的两组中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术，第一组微卫星四重PCR引物组合及序列如下：

EN0033正向序列为：5′-6-FAM-CCTTGACACGGCATTGATTGG-3′，反向序列为：5′-TACGTTGTGCAAACGCCA AGC-3′；

RS0622正向序列为：5′-VIC-TCAGTCCGTAGTTCATACTTGG-3′，反向序列为：5′-CACATGCCTTTGTGTGAAAACG-3′；

FCKR002正向序列为：5′-NED-CTCAACCCTCACCTCAGGAACA-3′，反向序列为：5′-AATTGTGGAGGCGACTAAGTTC-3′；

FCKR013正向序列为：5′-PET-GCACATATAAGCACAAACGCTC-3′，反向序列为：5′-CTCTCTCGCAATCTCTCCAACT-3′；

所述的两组中国对虾荧光标记微卫星四重PCR个体识别技术，第二组微卫星四重PCR引物组合及序列如下：

RS1101正向序列为：5′-6-FAM-CGAGTGGCAGCGAGTCCT-3′，反向序列为：5′-TATTCCCACGCTCTTGTC-3′

FCKR005正向序列为:5′-VIC-CATCGAATCTAAGAGCTGGAAT-3′，反向序列为：5′-TTTGTTTGTGAATAATGTGTGT-3′

FCKR007正向序列为:5′-NED-CGAAATAAGTTAAATGAAAAAA-3′，反向序列为：5′-CAACATAAGACTCACGAGACAG-3′

FCKR009正向序列为:5′-PET-GCACGAAAACACATTAGTAGGA-3′，反向序列为：5′-ATATCTGGAATGGCAAAGAGTC-3′。

2.根据权利要求1所述的一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法，其特在于所述的第一组微卫星四重PCR引物的反应体系为：25μl反应体系，其中包括2.5μl10×PCR缓冲液、四种荧光标记引物的浓度均为10μM，EN0033正反引物每条各为0.25μl，RS0622正反引物每条各为0.5μl，FCKR002正反引物每条各为0.5μl，FCKR013正反引物每条各为0.5μl；100ng基因组DNA、250μmol/LdNTPs 2.5μl、2.0mmol/L Mg²⁺ 2.0μl、1单位Taq DNA聚合酶，余量用双蒸水补足。

3.根据权利要求1或2所述的一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法，其特在于所述的第一组微卫星四重PCR引物的PCR扩增程序为：94℃变性4min后进行循环1：94℃变性40s，70℃退火1min，每个循环退火温度降低1℃，72℃延伸1min，共循环5次；随后进行循环2：94℃变性40s，65℃退火1min，72℃延伸1min，共循环8次；再进行循环3：94℃变性40s，64℃退火1min，每个循环退火温度降低1℃，72℃延伸1min，共循环4次；进行循环4：94℃变性40s，61℃退火1min，72℃延伸1min，共循环12次；最后72℃延伸5min，4℃保存并结束程序。

4.根据权利要求1所述的一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法，其特在于所述的第二组微卫星四重PCR引物的反应体系为：25μl反应体系，其中包括2.5μl10×PCR缓冲液、四种荧光标记引物的浓度均为10μM，EN 0033正反引物每条各为0.25μl，RS0622正反引物每条各为0.5μl，FCKR002正反引物每条各为0.5μl，FCKR013正反引物每条各为0.5μl；100ng基因组DNA、250μmol/LdNTPs 2.5μl、2.0mmol/L Mg²⁺2.0μl、1单位Taq DNA聚合酶，余量用双蒸水补足。

5.根据权利要求1或4所述的一种可对放流中国对虾实现精确追溯的放流方法，其特在于所述的第二组微卫星四重PCR引物的PCR扩增程序为：94℃变性4min后进行循环1：94℃变性40s，52℃退火1min，72min延伸1min，共循环10次；随后进行循环2：94℃变性40ｓ，51℃退火1min，每个循环退火温度降低0.5℃，72℃延伸1min，共循环4次；再进行循环3：94℃变性40ｓ，49℃退火1min，72℃延伸1min，共循环10次；最后72℃延伸5min，4℃保存并结束程序。