[发明专利]一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly  SEQ ID NO：1。

2.根据权利要求1所述的金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽，其特征在于：所述的抗氧化肽的HR-ESI-MS检测的分子离子峰为m/z 539.2096 Da [M+H]⁺。

3.一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）以脱脂金枪鱼碎肉作为原料，加入缓冲液调节pH到5.0 ~ 7.0，得混合液；

2）将混合液温度升至55 ℃ ~ 65 ℃搅拌预热，按照脱脂鱼肉质量的0.8 % ~ 1.2 %加入木瓜蛋白酶，酶解温度为55 ℃ ~ 65 ℃，酶解时间1 h ~ 3 h，得酶解产物；

3）将得到的酶解产物先经灭酶处理得酶解液，再将酶解液依次经脱盐、超滤和层析，得到抗氧化肽。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）中的脱脂金枪鱼碎肉的制备过程为：将洗净除杂的金枪鱼碎肉按照固液比1 g:1 mL ~ 2 mL放入缓冲液中，用高速组织捣碎机将其处理成匀浆，然后按照体积比1:2~ 4放入乙醚中脱脂20 ~ 25 h，用冷冻离心机在3~5℃温度下以4000 ~ 5000 rpm离心10 ~ 15 min除去乙醚，收集固形物即得到脱脂金枪鱼碎肉。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤2）中的木瓜蛋白酶的酶活力≥1.5×10⁶ U/g。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）中的灭酶处理为：将酶解产物升温至90 ℃~ 95℃，并于此温度保持10 min~15min后，冷却至15 ℃~ 25 ℃，然后离心，得酶解液。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）的脱盐、超滤和层析的具体过程为：

脱盐：将得到的酶解液制成浓度为15 mg/ mL ~ 20 mg/mL溶液，加入到大孔树脂层析柱进行脱盐，然后用质量浓度45~55%乙醇进行解析，40 ℃以下低压旋蒸除去乙醇，浓缩液进行冷冻干燥，得脱盐酶解物干粉；

超滤：将脱盐后的酶解物干粉溶于pH 5.5~6.5的磷酸盐缓冲液配成8~12 mg/mL的溶液，于0.1 ~ 0.15 MPa的工作压力和20 ~ 25 ℃的工作温度下采用超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，得超滤酶解液；

层析：将上述超滤酶解液用pH 5.5~6.5的磷酸盐缓冲液配成8~12 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用水、0.09~0.11 mol/L、0.45~0.55 mol/L和0.90~1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解液；将所述离子交换层析酶解液用pH 5.5~6.5磷酸盐缓冲液配成8~12 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解液，将上述凝胶层析酶解液用pH 6.0磷酸盐缓冲液配成45~55 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱RP-HPLC进行纯化。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述大孔树脂为D101；所述阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25；所述反相高效液相色谱条件为：进样量19~21 μg；色谱柱为Zorbax C18；柱温为25 ℃；流动相：A含0.1%三氟乙酸的水，B含0.1%三氟乙酸的乙腈；梯度洗脱：0-55 min乙腈浓度从0至50%，每5 min增加5%；洗脱速度1.0 ml/min；紫外检测波长280 nm。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述金枪鱼碎肉为鲣鱼（Katsuwonus pelamis）碎肉。

10.一种金枪鱼碎肉蛋白抗氧化肽的应用，其特征在于Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly  SEQ ID NO：1对DPPH 自由基、羟基自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基的清除的应用； Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly  SEQ ID NO：1对脂质过氧化抑制的应用；Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly  SEQ ID NO：1作为药品、保健食品和食品添加剂的应用。