[发明专利]使用肠杆菌科细菌产生L-氨基酸的方法

说明书

本申请是申请日为2007年7月12日，申请号为“200780027157.1”(国际申请号为“PCT/JP2007/064304”)，名称为“使用肠杆菌科细菌产生L-氨基酸的方法”的发明专利申请的分案申请。 

技术领域

本发明涉及微生物工业，具体涉及通过使用具有增强的醇脱氢酶活性的细菌进行发酵来产生L-氨基酸的方法，所述L-氨基酸如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-谷氨酸和L-亮氨酸。 

背景技术

常规而言，在工业上通过利用从天然来源获得的微生物菌株或其变体的发酵方法产生L-氨基酸。通常对微生物进行修饰以提高L-氨基酸的产率(production yield)。 

已经报道过许多提高L-氨基酸产率的技术，包括用重组DNA转化微生物(美国专利No.4,278,765)。用于提高产率的其它技术包括增加氨基酸生物合成中涉及的酶的活性和/或使目标酶对产生的L-氨基酸的反馈抑制脱敏(美国专利Nos.4,346,170、5,661,012和6,040,160)。 

通过优化期望的化合物的主要生物合成途径，能够实现对产生L-氨基酸的菌株的进一步改进。通常这通过为细菌补充越来越大量的碳源(如糖，例如葡萄糖)来实现。无论通过PTS的葡萄糖转运的效率为何，但是在高产菌株中对碳源的获取(access)却仍可能不足。另一种增加产生L-氨基酸的菌株的生产力和降低目标L-氨基酸成本的方法是使用替代性(alternative)的碳源，如醇，例如乙醇。 

大肠杆菌的醇脱氢酶(乙醇氧化还原酶，AdhE)是一种多功能酶，其通过两个连续的NADH-依赖性乙酰辅酶A还原反应，以及使将丙酮酸切割成乙酰辅酶A和甲酸的丙酮酸甲酸裂合酶来催化乙醇的发酵生产。 

AdhE在葡萄糖存在下在厌氧生长的过程中大量合成(约3x10⁴拷贝每细 胞)，并形成称为螺旋体(spirosome)的螺旋结构，这些螺旋结构大约0.22μm长，含有40-60个AdhE分子(Kessler,D.,Herth,W.和Knappe,J.,J.Biol.Chem.,267,18073-18079(1992))。当将大肠杆菌细胞培养从厌氧条件转换至有氧条件时，adhE基因的转录降低，并维持在于厌氧条件下所得范围的10%以内(Chen,Y.M.和Lin,E.C.C.,J.Bacteriol.173,8009-8013(1991)；Leonardo,M.R.,Cunningham,P.R.和Clark,D.P.,J.Bacteriol.175,870-878(1993)；Mikulskis,A.,Aristarkhov,A.和Lin,E.C.C.,J.Bacteriol.179,7129-7134(1997)；Membrillo-Hernandez,J.和Lin,E.C.C.,J.Bacteriol.181,7571-7579(1999))。翻译也受到调节，并且需要RNA酶III(Membrillo-Hernandez,J.和Lin,E.C.C.,J.Bacteriol.181,7571-7579(1999)；Aristarkhov,A.等,J.Bacteriol.178,4327-4332(1996))。已将AdhE鉴定为大肠杆菌细胞经受过氧化氢应激(hydrogen peroxide stress)时的主要靶物之一(Tamarit,J.,Cabiscol,E.和Ros,J.,J.Biol.Chem.273,3027-3032(1998))。 

尽管由AdhE催化的两个NADH-偶联反应具有可逆性，野生型大肠杆菌也无法在乙醇作为唯一碳源和能源存在时生长，因为adhE基因在有氧条件下以低水平转录(Chen,Y.M.和Lin,E.C.C.,J.Bacteriol.73,8009-8013(1991);Leonardo,M.R.,Cunningham,P.R.&Clark,D.P.,J.Bacteriol.175870-878(1993))，并且在有氧代谢过程中AdhE蛋白的半衰期因金属催化的氧化(MCO)而缩短。