[发明专利]一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌、其构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌、其构建方法及应用。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV)引起的以腹泻、呕吐和脱水为特征的猪肠道传染病(Bi et al.2012;Pan etal.2012;Song and Park 2012)。从2010年以来，猪流行性腹泻病开始在全国流行，导致仔猪腹泻，甚至死亡，给养猪业造成了严重的损失(毛雅元2010)。目前，传统的猪流行性腹泻疫苗已经不能完全控制疫情的传播和发生。在此情况下，研制新型的猪流行性腹泻疫苗非常必要。

PEDV纤突（spike,S）糖蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原表位，是诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的主要结构蛋白(Duarte and Laude 1994;Chang et al.2002)。实践证明，肠道黏膜免疫所产生的分泌型抗体(sIgA)是抵抗PEDV感染的有效抗体。其中，PEDV S糖蛋白中COE基因被证明是主要的抗原保护性基因(Kang et al.2005)。

乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是一种易通过黏膜吸收的常在菌，适量的乳酸菌对维持肠道菌群平衡具有积极意义。NIZO公司近年来开发了乳酸乳球菌载体表达系统，在该载体上表达的外源基因很容易通过黏膜吸收，另外，该载体为食品级，不含有任何抗生素基因或其他有害成分(de Ruyter et al.1997;Hernandez et al.2007;Chen et al.2011)。利用该表达系统研制的疫苗，不仅具有良好的免疫效果，而且具有易吸收、无副作用的特点。

发明内容

根据目前国内外关于猪流行性腹泻病毒防治研究的现状和疫苗研制的最新进展，本发明提出一种采取目前NIZO公司提供的最新乳酸乳球菌表达载体pNZ8149（含有乳糖基因）来装载PEDV的免疫保护性抗原S(COE)基因，并转化入缺失乳糖表达基因的乳酸乳球菌，构建重组菌，该重组菌的筛选不需要抗生素，也不含有任何对宿主细胞有害的生物因素，属于生物安全级的载体。然后将构建的重组菌免疫原接种小鼠，测定其体重增长、抗体产生及细胞免疫应答等情况，以衡量疫苗的免疫效果，本发明在猪流行性腹泻病毒乳酸菌载体疫苗方面有广阔的应用前景。

本发明的技术方案如下：RT-PCR扩增获得猪流行性腹泻病毒（PEDV）主要保护性抗原COE基因序列，并将其克隆测序。根据测序结果和表达载体特点，设计表达引物，扩增PEDVCOE编码序列，并将其连接至乳酸乳球菌表达载体pNZ8149，电转化入乳酸乳球菌NZ3900细胞内。重组菌以1ng/mL乳链菌肽（Nisin）诱导，通过SDS-PAGE和Western blot分析，PEDV主要S蛋白获得了表达。表达的重组菌经不同免疫方式接种4周龄小鼠，一周后采血应用ELISA方法检测血清中的PEDV抗体及IFN-γ，评价PEDV乳酸菌疫苗刺激产生的体液免疫与细胞免疫。同时，在免疫前后测定小鼠体重，评价疫苗对小鼠生长发育的影响。结果显示各免疫组对小鼠体重增加没有负影响，且略有增加；免疫后，10倍稀释口服组小鼠刺激产生的PEDV抗体最高，同时该组刺激产生的血清中IFN-γ也最高。该PEDV乳酸菌载体口服疫苗能够刺激小鼠产生体液免疫和一定的细胞免疫。

本发明的技术方案及意义：

PEDV感染具有明显的肠道嗜性。肠道黏膜表面sIgA含量的高低直接决定疾病的发生和严重程度[2～7]。本发明成功地克隆了PEDV主要保护性抗原基因COEN，通过序列比较分析，这株PEDV主要S基因核苷酸序列同已发表的Brl/87株PEDV相应序列同源性达到99.44％，说明该基因序列比较保守，可以作为PEDV基因工程疫苗的候选基因。Tae-Jin将PEDV Brl/87株中和抗原基因(K-COE)在烟草中表达，动物试验证实有良好的抗原性(Kang et al.2005)。

本发明针对PED免疫特点,在试验设计上以阻断肠道传染性疾病病原感染的第一道防线为目的,利用安全无毒的乳酸菌表达系统在肠道黏膜上粘附、定植和表达及传递抗原物质,因而抗原物质对黏膜的免疫刺激作用更接近于病毒的自然感染途径。因此，所产生的黏膜免疫保护效果将更为理想。