[发明专利]一种免疫荧光组织化学技术

说明书

技术领域

本发明属于免疫分析和生物技术应用领域，具体为一种免疫荧光组织化学技术。

背景技术

免疫荧光组织化学技术是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由Coons和他的同事（1941）建立。免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成为免疫荧光组织（或细胞）化学技术。它与葡萄球菌A蛋白（SPA）、生物素与卵白素、植物血凝素（ConA等）相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机、扫描电视和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫荧光组织化学技术；荧光激活细胞分类器Fluorescin activated cell sorter（FACS）的应用，激光共聚焦显微镜的问世，使免疫荧光细胞技术发展到更高阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。细胞显微分光光度计与图像分析仪的结合使免疫荧光组织化学的定量检测更加准确。80年代到90年代相继又有新的荧光素的出现，均在流式细胞仪和激光共聚焦显微镜中得到广泛应用。

免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗体（或抗原）标记上荧光素，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，荧光素受激发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光，利用荧光显微镜可以观察荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量。

例如：标本来源于心梗大鼠的心肌组织，检测A,B,C,D蛋白在心肌组织的表达情况及相互联系。

1、研究发现A,B,C,D蛋白在心肌梗死区、危险区和正常区域有不同表达，那么在心肌组织不同层面就会有不同的结果，若需同时观察这四种蛋白的表达情况则应在同一标本层面中实现。

2、目前普通免疫荧光常采用三种颜色的荧光标记：除了检测细胞核用DAPI蓝色荧光标记外，还可以用另外两种不同荧光分别标记两种蛋白。如检测A蛋白-兔抗大鼠（A蛋白对应一抗）-山羊抗兔-FITC（二抗）黄绿色荧光标记，吸收波长490-495nm，B蛋白-小鼠抗大鼠（B蛋白对应一抗）-山羊抗小鼠-TRITC（二抗）橙红色荧光标记，吸收波长为550nm，借助普通荧光显微镜即可观察到这三种颜色的荧光。

3、若需要同时观察A,B,C蛋白在心肌组织中的表达情况，则需C蛋白所结合的一抗种属来源于非兔、小鼠之外的抗体。然而目前抗体的种属来源较为单一，若C蛋白-兔抗大鼠（C蛋白对应一抗）-山羊抗兔-FITC（二抗）黄绿色荧光，将会无法区分A,C蛋白，且二抗会发生免疫交叉反应。同理，C蛋白的一抗若为小鼠来源，则与B蛋白无法区别。如果C蛋白-驴抗大鼠（C蛋白对应一抗），则相应的二抗又需要采用不同荧光素标记的抗驴的抗体，且激发该荧光需要不同的吸收波长，这是普通荧光显微镜所不能实现的，需采用激光共聚焦显微镜或更高级设备。若需要同时分析四种蛋白，则抗体的种属来源会受到更多限制，且更容易发生免疫交叉反应。

4、激光共聚焦显微镜虽然具有多通道的激发波长，具有可以同时检测几种不同荧光标记的蛋白的优点，但介于目前抗体的种属来源较少，仍然存在容易发生免疫交叉反应的问题，难以实现多种抗原的同步共定位。另外激光共聚焦显微镜使用费用相对较高，研究者常受到研究经费的限制，以及激光共聚焦显微镜还未得到普及等不足，因此不能被广泛应用。

综上所述，目前的免疫荧光组织化学技术常使用三种不同颜色的荧光标记，即细胞核DAPI蓝色荧光标记和两种抗原（或抗体）的另外两种不同荧光标记，通过荧光观察两种抗原（或抗体）在组织或细胞中的定位。若需同时观察第三种或更多种抗原（或抗体）在组织细胞中的定位，则只能通过选取另一层面标本观察。然而，目前该技术还存在一定的局限性：1、由于组织不同层面所反映的结果不尽相同，那么在不同层面标本上的结果则不能准确揭示各蛋白（抗原或抗体）之间的关系和特点；2、介于抗体的种属来源较少，实现多种抗原的同步共定位则尤为困难，且容易存在免疫交叉反应；3、不同荧光的激发需要不同的激发波长，若同时观察三种以上的荧光，则采用一般的普通荧光显微镜较难实现；4、激光共聚焦显微镜的使用费用较高，且所需抗体种属来源的限制以及激光共聚焦显微镜的使用由于受到各种因素的影响还难以广泛普及。

发明内容

    本发明为了解决现有免疫荧光组织化学技术在使用过程中存在上述诸多缺陷的问题，提供一种新的免疫荧光组织化学技术，利用普通荧光显微镜和有限的抗体来源实现多于三种抗原（或抗体）在同一标本中的共定位。从而对相应抗原（或抗体）进行组织或细胞的准确定性、定位、定量。