[发明专利]6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物制药和绿色化学领域，具体涉及一种6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法。

背景技术：

降胆固醇的他汀类药物是目前世界最畅销的药物大类。2010年世界最畅销药物，辉瑞公司的立普妥(商品名称Lipitor，年销售额119亿美元)有效活性为阿托伐他汀(atorvastatin)(Nature 2012,485:185-194)。6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯是用于合成此类降胆固醇他汀类药物的关键手性中间体。目前可以通过化学法或酶法加以制备(Angew.Chem.Int.Ed.2005,44:362-365)。

目前化学法工艺生产6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯是利用硼烷类衍生物在-70摄氏度以下的条件下将6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯还原。该工艺需要极端反应条件，易燃，能耗严重并且产品的立体异构纯度只能达到98%(US 2009/0216029A1)。

美国的科德克希思公司开发的合成路线是利用源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的基因工程改造的酮还原酶催化从6-氰基-（5R）-羟基-3-氧代己酸叔丁酯到6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的还原反应，同时利用一种葡萄糖脱氢酶完成辅酶（NADPH）的再生反应。通过该工艺路线可以获得立体异构纯的6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯（de值大于99%）（WO 2008/042876A2）。

但是该工艺中存在着底物浓度较低，酶用量较大等问题，例如在该专利中制备产物的实例中，其初始底物浓度为300mg/mL，酶粉用量为底物的1.2%，辅酶用量为底物的0.05%，该种用量使得生产成本较高。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是提供一种改进的6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，其以6-氰基-（5R)羟基-3-氧代己酸叔丁酯为底物，该底物在生物催化剂、辅因子和辅因子再生系统的存在下发生还原反应生成6-氰基-（3R,5R）-二羟基己酸叔丁酯，所述的生物催化剂为酮还原酶，所述的辅因子再生系统包括葡萄糖和葡萄糖脱氢酶，所述的还原反应在pH为6~8的水相缓冲液中进行，在起始时的反应体系中，所述的底物6-氰基-（5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的浓度为350~400mg/mL，所述的酮还原酶与所述的底物6-氰基-（5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量比为0.005~0.04:1。

进一步地，在起始时的反应体系中，所述的辅因子：所述的葡萄糖：所述的葡萄糖脱氢酶;所述的6-氰基-（5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯的质量比为0.0005~0.002：0.9~1.8：0.01~0.04：1。

进一步地，所述的辅因子为NAD/NADH或NADP/NADPH。

优选地，所述的辅因子为NADP/NADPH。

优选地，所述的水相缓冲液为三乙醇胺盐酸缓冲溶液。

优选地，所述的还原反应在pH为7.0的水相缓冲液中进行。

进一步地，所述的制备方法的实施过程如下：在反应容器中依次加入葡萄糖、所述的水相缓冲液，搅拌均匀，继续加入底物6-氰基-（5R)-羟基-3-氧代己酸叔丁酯，搅拌均匀，用氢氧化钠溶液调节pH6~8，再继续加入葡萄糖脱氢酶和酮还原酶，用氢氧化钠溶液调节pH6~8，再加入所述的辅因子，用氢氧化钠溶液维持pH6~8，搅拌反应，利用LC-MS检测反应进程，待转化率达90~99%时，结束反应。

本发明所采用的酮还原酶（苏州汉酶生物技术有限公司，KRED101）、葡萄糖脱氢酶（苏州汉酶生物技术有限公司，GDH102）均可商购获得。

本发明的有益效果在于:

本发明通过对工艺条件的优化，提高底物浓度，降低酶用量，从而降低了生产成本，实现了高效率的生物转化过程，适合产业化生产。

具体实施方式：

本发明的反应式如下：

下面的实施例可以使本专业的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例一：反应监测方法