[发明专利]一种共表达UPR关键基因和下游靶基因增强葡萄糖氧化酶分泌的方法

说明书

技术领域

一种共表达UPR关键基因和下游靶基因增强分泌表达葡萄糖氧化酶的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

葡萄糖氧化酶是生物领域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks将GOD固定在Clark氧电极表面，将其应用于血糖测定以来，GOD被广泛应用于食品、饲料、医药等许多相关领域。

在食品工业中，由于氧的存在，引起许多不利于产品质量的化学反应，并为许多微生物生长创造了条件。目前，许多国家已将GOD作为工人的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中。虽然用途多样，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。利用其专一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析仪，能快速准确简易地测定各种食品中的葡萄糖含量，指导生产。

在医药工业中，GOD作为试剂盒、酶电极等用于血清(浆)、尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析;GOD制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成防止口腔疾病和牙病的发生。此外，由于可以催化生成H₂O₂，还可用于对H₂O₂敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。

GOD还是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。含葡萄糖氧化酶、乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加剂，可用于预防牲畜胃肠道感染、腹泻，并有促进动物生长作用。

从动植物组织中提取GOD有一定的局限，酶量亦不丰富；细菌GOD产酶量少；一般采用具有GRAS资格的黑曲霉和青霉属菌株作为GOD生产菌。我国及美国均采用点青霉及产黄青霉生产GOD，日本常用尼崎青霉，俄罗斯用生机青霉，近年报道胶霉属Clioctadium、拟青霉属Paecilomyces和帚霉属Scopulariopsis也能生产GOD。但产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制性因素，国内外为此做了大量工作并取得了明显进展。目前国外生产的GOD厂家主要是德国的Boehringer和日本的TOYOBO。规模化生产高活性的GOD还有困难。发酵生产GOD的同时产生大量杂蛋白，分离提取复杂，成本高。

利用基因工程或发酵工程来研究GOD的过量表达。其酶学性质、分子改造最终为实现葡萄糖氧化酶的工业化生产奠定了一定的理论基础和策略导向。

发明内容

本发明提供了一种共表达UPR关键基因和下游靶基因增强分泌表达葡萄糖氧化酶的方法。

技术方案为：将毕赤酵母UPR关键基因Haclp连接到毕赤酵母表达载体pPICZα，下游靶基因Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sil1（其中Pdi1、Kar2为毕赤酵母来源基因，Ero1、Lhs1、Sil1为酿酒酵母来源基因）连接到表达载体pPIC3.5K，并将下游靶基因表达质粒分别同Haclp表达质粒一起将转化入Pichia pastorisGS 115-pPIC9K-GOD。

所述Haclp、Pdi1、Kar2为毕赤GS115来源基因，所述Ero1、Lhs1、Sil1为Saccharomycescerevisiae S288c来源基因。

具体步骤如下：

1）设计引物以毕赤酵母和酿酒酵母反转录cDNA为模板扩增出Haclp、Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sil1基因；

2）将Hac1p基因连接到毕赤酵母表达载体pPICZα，下游靶基因Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sil1（其中Pdi1、Kar2为毕赤酵母来源基因，Ero1、Lhs1、Sil1为酿酒酵母来源基因）连接到表达载体pPIC3.5K，得到重组质粒pPICZ-Hac1，pPIC3.5K-Pdi1,pPIC3.5K-Ero1,pPIC3.5K-Lhs1,pPIC3.5K-Ka2,pPIC3.5K-Sil1；

3）将步骤2）中重组载体pPICZ-Hac1分别与pPIC3.5K-Pdi1、pPIC3.5K-Ero1、pPIC3.5K-Lhs1、pPIC3.5K-Kar2、pPIC3.5K-Sil1转化入Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOD得到五株分泌增强型基因工程菌。

所述引物如下：

Hac-F：5’-AGTTCGAAATGCCCGTAGATTCTTCTC-3’