[发明专利]一种共表达UPR关键基因和下游靶基因增强葡萄糖氧化酶分泌的方法

权利要求书

1.一种共表达UPR关键基因和下游靶基因增强葡萄糖氧化酶分泌的方法，其特征在于，是将毕赤酵母UPR关键基因Haclp连接到毕赤酵母表达载体pPICZα上，将其下游靶基因连接到表达载体pPIC3.5K上，并将下游靶基因表达质粒与Haclp表达质粒一起转化入Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOD中得到的基因工程菌。 

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述下游靶基因为Pdi1或Kar2，来源于为毕赤酵母GS115。 

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述下游靶基因为Ero1、Lhs1或Sil1中任一一个，来源于Saccharomyces cerevisiae S288c。 

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Pichia pstorisGS115-pPIC9K-GOD，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2012266。 

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，构建基因工程菌的步骤如下： 

1）设计引物以毕赤酵母和酿酒酵母反转录cDNA为模板扩增出Haclp、Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sil1基因； 

2）将Haclp基因连接到毕赤酵母表达载体pPICZα，下游靶基因Pdi1、Ero1、Lhs1、Kar2、Sil1连接到表达载体pPIC3.5K，得到重组质粒pPICZ-Hac1，pPIC3.5K-Pdi1，pPIC3.5K-Ero1,pPIC3.5K-Lhs1,pPIC3.5K-Kar2,pPIC3.5K-Sil1； 

3）将步骤2）中重组载体pPICZ-Hac1分别与pPIC3.5K-Pdi1、pPIC3.5K-Ero1、pPIC3.5K-Lhs1、pPIC3.5K-Kar2、pPIC3.5K-Sil1转化入Pichia pastoris GS115-pPIC9K-GOD得到五株分泌增强型基因工程菌。 

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述引物如下： 

Hac-F：5’-AGTTCGAAATGCCCGTAGATTCTTCTC-3’ 

Hac-R：5’-AAATATGCGGCCGCCTATTCCTGGAAGAATACAAAGTC-3’ 

Pdi-F：5’-CGGGATCCATGCAATTCAACTGGGATATTAAAACTGTG-3’ 

Pdi-R：5’-AAATATGCGGCCGCTTAAAGCTCGTCGTGAGCGTC-3’ 

Ero-F：5’-CGGGATCCATGAGATTAAGAACCGCCAT-3’ 

Ero-R：5’-AAATATGCGGCCGCTTATTGTATATCTAGCTTAT-3’ 

Lhs-F：5’-CGGGATCCATGCGAAACGTTTTAAGGCTTTT-3’ 

Lhs-R：5’-AAATATGCGGCCGCCTATAATTCATCATGCAAAATGTCT-3’ 

Kar-F：5’-CGGGATCCATGCTGTCGTTAAAACCATCTT-3’ 

Kar-R：5’-AAATATGCGGCCGCTATCTACAACTCATCATGAT-3’ 

Sil-F：5’-CGGGATCCATGGTCCGGATTCTTCCCAT-3’ 

Sil-R：5’-AAATATGCGGCCGCTCAGAGTTCATCTCTGAAATTT-3’。