[发明专利]用于检测感染性眼病致病微生物的试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于感染性眼病致病微生物的快速检测技术领域，具体涉及一种用于检测感染性眼病致病微生物的试剂盒及检测方法，即通过直接PCR方法检测感染性眼病常见致病细菌、真菌、I型单纯疱疹病毒和棘阿米巴原虫的特异性DNA的试剂盒及检测方法。

背景技术

感染性眼病是眼部最常见的多发病，包括角膜炎、结膜炎和眼内炎等，引起眼部病变微生物主要有细菌、真菌、病毒和棘阿米巴原虫。角膜炎和眼内炎患者一旦诊治不及时就有致盲的危险，只有早期及时确诊是由哪种病原微生物感染所致，才能更好的指导后续治疗中的合理用药以及选择合适的手术时机。因此感染性眼病致病微生物的早期诊断对防盲、治盲意义重大。

由细菌感染引起的眼部炎症是最广泛的，其致病菌主要有葡萄球菌（表葡萄、金葡萄）、肺炎球菌和铜绿假单胞菌。真菌引起的眼部感染是目前我国最常见的致盲性眼病之一，调查发现镰刀菌属、曲霉菌属和链格孢菌属为最常见的真菌性角膜炎致病菌。引起角膜感染的常见病毒主要是I型单纯疱疹病毒。棘阿米巴原虫也主要引起角膜感染，随着角膜接触镜的佩戴，其发病率也在上升。

目前临床上对以上病原微生物引起的眼部感染尚无快速有效的早期诊断方法。病毒性感染主要依赖于观察病症特点及询问有无反复发作史或免疫印记来进行确诊，前两者依赖于主观性后者则阳性率较低。而对于细菌、真菌和棘阿米巴原虫引发的感染则主要是先行病变组织涂片染色检查，这种方法虽然较便捷，但是观察依赖于有丰富经验的技术人员。从病变样本中进行病原微生物的培养是明确诊断的最可靠依据，但是这种培养方法耗时长，不能提供早期诊断结果，延误治疗；由于患者之前的用药还可能会影响培养的阳性；而且培养这些病原微生物也需要专业技术人员和硬件条件的完善。各种病原标本的涂片和培养是目前比较常规的病原检测方法，其缺点是显而易见的，即鉴定无法标准规范化，且培养方法阳性率不够高，并需要较长时间。因此临床上亟需新的有效快速的感染性眼病致病微生物的诊断方法。利用分子生物学方法诊断病原微生物为眼部感染的快速诊断提供了新的思路。已有研究者将普通PCR的方法应用于细菌、真菌和病毒引起的感染诊断，对细菌的16S rRNA、真菌rRNA基因的大、小亚基和病毒种特异性序列进行扩增和分析，可有效鉴定至种属。普通PCR方法诊断病原虽然高效特异，但要先对样本进行模板DNA的提取，这个过程本身就会造成样本的损失；加上临床眼科病变样本量本来就很少，即使采用高效便捷的试剂盒提取方法，不同病原微生物DNA提取也需要不同的试剂盒。所以考虑到要进行DNA提取，那么普通PCR难以适应临床需要。直接PCR方法就可以避开DNA提取的步骤，将临床样本直接进行各种病原微生物特异性DNA的扩增，既大大缩短了检测的时间，又高效特异，而且需要的话还可以进一步进行种属鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测感染性眼病致病微生物的试剂盒及检测方法，以便快速、高效、准确地检测引发感染性眼病的细菌、真菌、I型单疱病毒和棘阿米巴原虫，省去临床病变样本DNA提取步骤，使得检测更加便捷。

本发明的试剂盒包括：

（1）DNA扩增试剂：

为2ХPCR预混试剂及相应的DNA聚合酶混合液；

（2）引物混合液：

包括有用于细菌、真菌、I型单疱病毒和棘阿米巴原虫检测的引物对，其信息如下：

细菌正向引物（BPF）: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG   SEQ ID NO:1

细菌反向引物（BPR）: ATTACCGCGGCTGCTGG      SEQ ID NO:2

真菌正向引物（FPF）: TCCGTAGGTGAACCTGCGG    SEQ ID NO:3

真菌反向引物（FPR）: TCCTCCGCTTATTGATATGC   SEQ ID NO:4

I型单疱病毒正向引物（HPF）: GTGCCGTTGTTCCCATTA  SEQ ID NO:5

I型单疱病毒反向引物（HPR）: TTTGTCCTTCTCGTCATCC  SEQ ID NO:6

棘阿米巴正向引物（APF）: TTAGAGTGTTCAAAGCAGGCAG SEQ ID NO:7

棘阿米巴反向引物（APR）: TGGTCGGCATCGTTTATG  SEQ ID NO:8

3)灭菌蒸馏水。

上述的试剂盒还包括有阳性对照核酸：