[发明专利]用于检测感染性眼病致病微生物的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.用于检测感染性眼病致病微生物的试剂盒，所述的试剂盒包括如下的组分：

1）DNA扩增试剂：

为2ХPCR预混试剂及DNA聚合酶混合液；

2）引物混合液：

包括有用于细菌、真菌、I型单疱病毒和棘阿米巴原虫检测的引物对，其信息如下：

细菌正向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:1、

细菌反向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:2、

真菌正向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:3、

真菌反向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:4、

I型单疱病毒正向引物的核苷酸序列为  SEQ ID NO:5、

I型单疱病毒反向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:6、

棘阿米巴正向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:7、

棘阿米巴反向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:8；

3)灭菌蒸馏水。

2.如权利要求1所述的试剂盒，还包括有阳性对照核酸：

阳性对照核酸分别为含有细菌、真菌、I型单纯疱疹病毒和棘阿米巴正反向引物扩增的目的片段的质粒，其中细菌扩增的目的片段的序列为SEQ ID NO:9；真菌扩增的目的片段的序列为SEQ ID NO:10；I型单纯疱疹病毒扩增的目的片段的序列为SEQ ID NO:11；棘阿米巴扩增的目的片段的序列为SEQ ID NO:12。

3.权利要求1或2所述的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

（1）临床样本的处理：病变角膜刮片用20μL灭菌蒸馏水吹打重悬于小离心管；房水或玻璃体经高速离心后吸弃上清，最终收集20μL（含沉淀），然后用移液器吹打均匀；结膜囊棉拭子用500μL灭菌纯水吹打数次后弃拭子，余液同房水处理方法；

（2）致病微生物特异性DNA扩增体系的配置： 

分别在4个反应管中加入下列组分：

（3）致病微生物特异性DNA扩增程序（TouchDown法）：

步骤1: 98℃ 5分钟，

步骤2: 98℃ 30秒，

步骤3: 65℃ 30秒，每一个循环温度降低0.5℃，

步骤4: 72℃ 30秒，

步骤5: 重复2、3、4步骤9个循环，

步骤6: 98℃ 30秒，

步骤7: 60℃ 30秒， 

步骤8: 72℃ 30秒，

步骤9: 重复6、7、8步骤25个循环，

步骤10: 72℃ 10分钟，

步骤11: 4℃ 保持；

（4）致病微生物特异DNA的琼脂糖凝胶电泳检测：

常规琼脂糖凝胶电泳检测各致病微生物特异性DNA，根据扩增产物分子量是否与各致病微生物特异性DNA预定分子量相符确定有无阳性扩增，从而确定引发感染性眼病的致病微生物种类。