[发明专利]一种重组磷脂酶D的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用基因工程菌发酵生产磷脂酶D的方法，尤其是一种重组磷脂酶D的生产方法。

背景技术

磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）)是磷脂家族成员之一，它是唯一能够调控细胞膜关键蛋白功能状态的磷脂，具有独特的理化性质和营养价值，被广泛应用于食品、保健品和医药行业。PS可影响脑内化学讯息的传递，并帮助脑细胞储存和读取资料，是维持大脑正常记忆力、反应和健康情绪的重要营养元素。近20年来国内外的动物试验及临床应用表明PS的主要功效有：（1）提高大脑机能，改善老年痴呆症；（2）帮助修复大脑损伤；（3）缓解压力，促进用脑疲劳的恢复、平衡情绪。

PS的制备方法主要有化学合成法、提取法和酶转化法。化学合成法工艺控制难度大、产品成分复杂，目前仅限于实验室规模。提取法主要是从植物细胞、动物的卵磷脂中提取PS，从动物中提取国外大部分以牛、羊、兔、马、驴等家禽的动物脑为原料来提取，但是近年来由于疯牛病等动物疾病的原因，利用动物细胞提取PS的方法，其提取产品的安全性受到人们的怀疑，现在已处于淘汰边缘；大豆磷脂中PS含量丰富，经过大量的临床研究，证明从大豆磷脂中提取的PS是一种更安全的、可以用作保健食品的原料，但是从大豆磷脂中提取PS仍存在诸多问题：（1）目前采用有机溶剂萃取法，需要消耗大量的有机溶剂，有机溶剂回收能耗大，此外，有机溶剂的使用对环境有一定的危害性；（2）大豆中磷脂成分复杂多样，各磷脂成分结构相似，性质相近，因此PS提取困难，产品纯度低，常含有其它磷脂；（3）最关键的问题是大豆磷脂中PS含量较低，磷脂类物质占大豆总重1.6-2.0%，这其中PS只占0.5-1%，既每公斤大豆中只含有80-200毫克PS，再加上分离纯化成本，造成提取的PS产品价格极高。酶转化法是以天然的卵磷脂为基质，加入丝氨酸，在磷脂酶D（PLD）的作用下，生成PS，其反应原理是酶类催化转酰基反应。酶法合成条件温和、产物纯度高、制备量大是生产PS最理想的方法，受到国内外研究人员的广泛关注（参见中国专利申请文献CN102277394A、CN101319237A、CN101230365A；美国专利文献：US6878532B1、US005700668A；SCI文献：J Lipid Res,1990,31:1719-1721、JAOCS,2003,80:653-657）。

PLD活力的高低和制备的难易程度是决定酶转化法工艺是否经济的关键因素。PLD首先发现于植物中（如卷心菜、花生等作物），之后在微生物（链霉菌、沙门氏菌）和哺乳动物细胞中均有发现，其研究历史已有五十年左右，取得了丰富的研究成果，但是距工业化生产PS的需要还有较大差距，这是因为PLD在动植物体内含量低，分离提纯工艺复杂，且活力也不高，导致PLD价格非常昂贵。来自于微生物界的PLD相比较于动植物界的有更强的转酯能力，其中又以链霉菌属的PLD转酯能力尤为突出，但是目前微生物发酵法生产PLD主要采用野生链霉菌或经简单物理化学诱变的链霉菌，发酵周期长（一般要7天）、产酶水平低、生产成本高，给实际应用带来很多困难。利用大肠杆菌重组表达并通过高密度培养可能是一个不错的解决方案。国内天津科技大学的路福平、日本名古屋大学的Yugo Iwasaki、意大利国家研究委员会的Carlo Zambonelli等尝试将链霉菌的PLD基因在大肠杆菌中进行表达，但是PLD主要以无活性的包涵体存在，经过发酵条件优化酶活也只与野生菌相当或略高，仍然无法实现大规模生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组磷脂酶D的生产方法，目的在于克服现有技术中大肠杆菌重组表达PLD包涵体多、发酵酶活低等问题，提供一种大肠杆菌重组表达PLD包涵体少、发酵酶活高、成本低的生产方法。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种重组PLD的生产方法，包括以下步骤：

（1）构建重组基因工程菌，所述基因工程菌为表达了PLD的重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌的构建方法按照常规分子生物学操作完成（参考pET系统操作手册，第10版，2002年；《分子克隆》，科学出版社，第二版，2002年）；

（2）配制摇瓶种子培养基和发酵培养基；

（3）将构建的重组基因工程菌在平板上活化16~20小时，再挑取在平板上活化后的基因工程菌接种至装有摇瓶种子培养基的摇瓶中，在37℃的条件下振荡培养10-16小时，得到种子液；