[发明专利]一种重组磷脂酶D的生产方法

权利要求书

1.一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）构建重组基因工程菌，该基因工程菌为表达了磷脂酶D的重组大肠杆菌；

（2）配制摇瓶种子培养基和发酵培养基；

（3）将构建的重组基因工程菌在平板上活化16~20小时，再挑取在平板上活化后的基因工程菌接种至装有摇瓶种子培养基的摇瓶中，在37℃的条件下振荡培养10-16小时，得到种子液；

（4）将得到的种子液接入发酵培养基中进行发酵，接种比例按照种子液/发酵培养基（V/V）为1%~10%进行；发酵培养的温度控制在20~37℃，发酵液的pH值控制在6.5~7.5，溶氧控制在20%~40%；当发酵液中的细胞光密度OD600在0.5~0.9时，向发酵液中添加诱导剂至其在发酵液中的终体积浓度为1%~5%；然后继续发酵32~48小时；

（5）从发酵液的培养物中获得磷脂酶D即可。

2.如权利要求1所述的一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于：步骤（1）中重组基因工程菌的构建采用的质粒为默克公司开发的pET系统质粒；采用的宿主菌为默克公司开发的BL21系列大肠杆菌；采用的磷脂酶D基因来源于微生物。

3.如权利要求2所述的一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于：步骤（1）中重组基因工程菌的构建采用的质粒为默克公司开发的pET系统质粒pET-32(a)；采用的宿主菌为默克公司开发的BL21系列大肠杆菌BL21(DE3)pLysS；采用的磷脂酶D基因来源于微生物链霉菌。

4.如权利要求1所述的一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于：步骤（2）中摇瓶种子培养基的组成包括甘油8~12g/L、胰蛋白胨15~25g/L、酵母膏8~12g/L、磷酸氢二钠2.5~7.5g/L和氨苄青霉素钠30~50mg/L，上述物品溶于去离子水中，定容到1L，用盐酸或氢氧化钠调节pH值为6.5~7.5。

5.如权利要求1所述的一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于：步骤（2）中发酵培养基的组成包括糊精20~50g/L、鱼蛋白胨10-30g/L、安琪酵母膏5~15g/L、基础盐20~50mL/L、微量元素10~30mL/L、氨苄青霉素钠30~100mg/L，上述物品溶于去离子水中，定容到1L。

6.如权利要求5所述的一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于：其中基础盐的组成为：K₂HPO₄·3H₂O占50g/L、KH₂PO₄占20g/L、(NH₄)₂SO₄占2g/L、NaCl占2g/L、NaHPO₄·12H₂O占70g/L、CaCl₂占1.2g/L、MgSO₄占3.5g/L；而微量元素的组成为：FeSO₄·7H₂O占2g/L、CoCl₂·6H₂O占0.4g/L、ZnCl₂占0.3ug/L、Na₂MoO₄·2H₂O占0.2g/L、CuSO₄·5H₂O占0.1g/L、MnSO₄·H₂O占0.08g/L、H₃BO₄占0.06ug/L。

7.如权利要求1所述的一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于：步骤（4）中添加诱导剂前，用盐酸或氢氧化钠控制发酵液的pH值在6.5~7.0之间，控制发酵温度在28~37℃，控制溶氧在30%~40%，诱导时机为OD600在0.5~0.9之间。

8.如权利要求1所述的一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于：步骤（4）中添加诱导剂后，用盐酸或氢氧化钠控制发酵液的pH值在7.0~7.5之间，控制发酵温度在20~28℃，控制溶氧在20%~30%，诱导表达时间长度为32~48小时。

9.如权利要求1所述的一种重组磷脂酶D的生产方法，其特征在于：步骤（4）中的诱导剂为乳糖。