[发明专利]Lmx1a介导的与神经干细胞共培养诱导rASCs为DA能神经元的方法

说明书

技术领域

    本发明属于分子细胞生物学，特别是诱导干细胞替代缺损的神经元细胞以治疗帕金森氏病的方法。

背景技术

帕金森氏病(Parkinson’s disease, PD)是一种中老年常见的慢性神经系统退行性变性疾病，主要病理特征是黑质多巴胺（Dopamine，DA）能神经元的选择性变性丢失和残存于神经元内含大量α- 突触核蛋白(α-synuclein) 、synphilin-1 和Parkin 等成分的路易小体(Lewy bodies)形成对于帕金森氏病。临床治疗多以药物治疗为主，不能从根本上去除病因，也不能延缓疾病的进程，而且随着长期用药和疾病的发展，效果进行性下降，副作用日趋严重。在脑血管病人增加、与环境污染导致的重金属和化学物质接触以及生活压力等多重因素影响下，帕金森病呈增长趋势，出现年轻化，患者和社会的负担越来越重。

细胞替代治疗是重建受损神经系统的组织结构，恢复神经系统功能的一种有效策略。按照传统观念，成年哺乳动物的中枢神经系统（ central nervous system，CNS）属于完全有丝分裂后的组织，不具有自我更新和修复的能力。因此，研究者把重建神经系统功能的重点放在胚胎组织的移植上，利用胚胎脑组织移植治疗神经系统疾病动物模型和患者，在实验和临床研究中取得了成功的经验。但移植胚胎组织存在形成畸胎瘤的风险和伦理道德要求，限制了移植治疗的广泛应用。因此，较为理想的方法就是找到能产生多巴胺的细胞或能分化成多巴胺能神经元的干细胞，从根本上解决多巴胺能神经元细胞的来源。

研究早期，研究人员将胚胎干细胞直接移植到帕金森病小鼠模型体内，胚胎干细胞可以部分分化为TH阳性的神经元，但把小剂量的胚胎干细胞移植到帕金森病小鼠模型黑质核团，数周后约20%的小鼠的大脑内出现畸胎瘤。细胞替代疗法尤其是帕金森氏病的细胞治疗要解决的关键问题是选择合适的替代细胞。间充质干细胞由于具有组织修复特性、自我更新及增殖分化、取材简单、资源丰富等特点而成为了PD细胞替代治疗的理想候选细胞。

目前，尽管中胚层间充质干细胞向DA能神经元定向分化尚无十分高效的诱导方法，但却受到研究人员重视，其分子机制逐渐被揭示和认识。在胞外发育信号的诱导下，脂肪来源的间充质干细胞（Rhesus adipose stem cells，rASCs）能够向其他的细胞系诱导分化，但其分化分子机制却知之甚少。研究表明，Lmx1a是多巴胺能神经元发育过程中的关键调控因子，能够启动神经元细胞的发育程序，使小鼠胚胎干细胞分化为多巴胺能神经元。但是，多巴胺能神经元的分化是多因素、多步骤诱导的复杂过程，需要细胞内部和外部多条信号通路在不同时间协调作用，激活多种转录因子，引起细胞广泛的基因表达谱的变化。

神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）是存在于中枢神经系统中具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。除了在体内能分化为神经元、星形胶质细胞核少突胶质细胞外，还能够分泌大量的营养因子，如GDNF、Neuturin等，对神经元细胞进行营养保护。

发明内容

本发明的目的是以恒河猴为研究对象，提供一种采集恒河猴的脂肪间充质干细胞进行体外培养，进而在Lmx1a介导下与神经干细胞共培养将rASCs转分化为DA能神经元的方法。

本发明Lmx1a介导的与NSCs共培养诱导rASCs为DA能神经元的方法，包括以下步骤：

    步骤（1）：构建Lmx1a基因克隆及重组质粒

    以Lmx1a whole transcript cDNA（NM_138396）为模板，引物为：

    P1 up：5′-GCGTCGACGTACCATGCTGGACGGCCTAAAG-3′，

    P1 down：5′-CGGGATCCCGCTTATCAAGATGTGAAGTAAG-3′，

通过PCR扩增获得带SalI和EcoR V酶切位点的DNA片段，将该片段插入pShuttle-CMV中，通过SalI和EcoR V双酶切鉴定，得到重组穿梭质粒pShuttleCMV-Lmx1a，测序并与理论结果一致；

    步骤（2）：构建与包装重组腺病毒Ad-Lmx1a